[發明專利]一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法

在審

• 申請號: 201810189688.0
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108220204A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 郭鶯;汪文華;劉黎卿;孟紅巖;郭遲鳴;林志楷;林文珍
• 申請（專利權）人: 福建省亞熱帶植物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

本發明公開了一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。采用FeSO₄和FeCl₃制得磁性納米顆粒，加入3?氨丙基三乙氧基硅烷，調pH值，攪拌；洗滌干燥，得到氨基化的Fe₃O₄納米粒子；再加入戊二醛反應，加入Lxx多克隆抗體后攪拌，洗滌后用磁石收集；將過濾后的蔗汁加入其中混勻后孵育，離心棄上清，用PBS緩沖液清洗后獲得Lxx。本發明方法具有分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備、污染率低等優點，更重要的是可在不改變細菌狀態下快速將Lxx病原菌從甘蔗中分離出來，用于研究在當下狀態下細菌的轉錄組和代謝組，解決了細菌與病原菌互作過程中無法快速獲得大量病原菌的問題。

技術領域

本發明涉及菌株分離方法，尤其涉及一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

背景技術

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)的致病菌的體外培養非常困難，盡管在1944年就發現，但是一直到1980年Davis才成功分離培養。我國有關RSD病原菌分離培養的報道較少，2008年陳健文等利用改良的SC培養基,從甘蔗蔗汁中分離培養到一種桿狀細菌,根據菌落的形態特征,并結合血清學和PCR檢測方法,確認所分離到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx；2015年張小秋等利用改良的MSC培養基成功分離Lxx，同年王麗也成功分離了RSD病原菌。

目前仍然還有很多實驗室沒有辦法重復分離Lxx，主要原因是該菌本身生長特別緩慢，往往需要4周左右的時間才能在培養皿上觀察到菌落，由于培養時候長，一旦有雜菌產生，分離就失敗，所以控制污染是Lxx菌分離培養的關鍵環節，相對于其它細菌來說這種分離培養的可重復性較差。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備、污染率低的快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

為實現上述目的，本發明提供一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步驟：

納米磁珠的制備：取FeSO₄和FeCl₃混合倒入三口燒瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器上，在充氮氣的條件下攪拌到溶解，調pH值至為8-10，溶液立即變為黑色，繼續反應，制得磁性納米顆粒；置于磁場中棄上清液后，用去離子水洗滌后干燥；

納米磁珠的氨基化：取上述所得磁性納米顆粒，溶解在無水乙醇中，超聲波處理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，調節pH值為10-12，在水浴中攪拌反應過夜；結束后用去離子水反覆洗滌后冷凍干燥，得到氨基化的Fe₃O₄納米粒子；

氨基化納米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe₃O₄納米粒子溶于PBS，超聲得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室溫下攪拌反應；再PBS洗滌后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化納米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制備：將Lxx多克隆抗體加入到上述所得活化后的氨基化納米磁珠中后攪拌，再用PBS洗滌后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分離：將過濾后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混勻后孵育，低速離心棄上清，用PBS緩沖液清洗后獲得Lxx的分離物。

進一步，所述納米磁珠的制備步驟中，FeSO₄和FeCl₃的摩爾比為2：(2-6)；優選的，FeSO₄和FeCl₃的摩爾比為2:3。

任選的，調節pH值時的溫度為70-80℃；優選的，溫度為75℃；

任選的，繼續反應30min；

任選的，用去離子水洗滌三次后干燥。