[發明專利]一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法

在審

• 申請號: 201810189688.0
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108220204A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 郭鶯;汪文華;劉黎卿;孟紅巖;郭遲鳴;林志楷;林文珍
• 申請（專利權）人: 福建省亞熱帶植物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 秦華

1.一種快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步驟：

納米磁珠的制備：取FeSO₄和FeCl₃混合倒入三口燒瓶置于恒溫加熱磁力攪拌器上，在充氮氣的條件下攪拌到溶解，調pH值至為8-10，溶液立即變為黑色，繼續反應，制得磁性納米顆粒；置于磁場中棄上清液后，用去離子水洗滌后干燥；

納米磁珠的氨基化：取上述所得磁性納米顆粒，溶解在無水乙醇中，超聲波處理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，調節pH值為10-12，在水浴中攪拌反應過夜；結束后用去離子水反覆洗滌后冷凍干燥，得到氨基化的Fe₃O₄納米粒子；

氨基化納米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe₃O₄納米粒子溶于PBS，超聲得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室溫下攪拌反應；再PBS洗滌后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化納米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制備：將Lxx多克隆抗體加入到上述所得活化后的氨基化納米磁珠中后攪拌，再用PBS洗滌后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分離：將過濾后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混勻后孵育，低速離心棄上清，用PBS緩沖液清洗后獲得Lxx的分離物。

2.如權利要求1所述快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述納米磁珠的制備步驟中，FeSO₄和FeCl₃的摩爾比為2：(2-6)；優選的，FeSO₄和FeCl₃的摩爾比為2:3。

任選的，調節pH值時的溫度為70-80℃；優選的，溫度為75℃；

任選的，繼續反應30min；

任選的，用去離子水洗滌三次后干燥。

3.如權利要求1所述快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述納米磁珠的氨基化步驟中，所述磁性納米顆粒：無水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比為(40-60)mg：(80-120)mL：(5-8)mL；優選的，磁性納米顆粒：無水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比為50mg：100mL：6mL；

任選的，用氨水調節pH值為10-12；優選的，用氨水調節pH值為11；

任選的，水浴的溫度為50-70℃；優選的，水浴的溫度為60℃。

4.如權利要求1所述快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述氨基化納米磁珠活化步驟中，所述氨基化的Fe₃O₄納米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比為(8-15)mg：(8-15)mL：(2-3)mL；優選的，氨基化的Fe₃O₄納米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比為10mg：10mL：2.5mL；其中PBS的濃度為0.01M，pH值為7.4；

任選的，攪拌反應的時間為6h；

任選的，洗滌的次數為3次。

5.如權利要求1所述快速分離甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述Lxx免疫磁珠的制備步驟中，所述Lxx多克隆抗體的制備方法為：

Lxx抗原制備：將過濾后的蔗汁涂布于含有萘啶酸的新鮮MSC培養基，暗培養，30-50天后觀察并挑取菌落；

Lxx抗體制備：利用上述挑取的菌落加入0.4％的甲醛滅活，加入弗氏佐劑，直接注射兔子，兩周打一次，共免疫4次，二個月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B作親和層析介質純化得到抗體；

優選的，所述過濾后的蔗汁為切取甘蔗莖基部，進行表面清洗滅菌后放入超凈臺中晾干；將蔗莖切成適合大小用鑷子擠汁，4000r/min，離心10min后收集蔗汁，用普通濾紙進行初步過濾后再用0.45μm細菌過濾器進行過濾。