[發(fā)明專利]一種枯草芽孢桿菌表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810189596.2
• 申請(qǐng)日: 2018-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN108409843A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海濤;苗利光;谷晨晨;劉艷環(huán);張斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所;石家莊市獸用生物制品供應(yīng)站
• 主分類號(hào): C07K14/35
• 分類號(hào): C07K14/35;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種枯草芽孢桿菌表達(dá)的牛分支桿菌ESAT?6蛋白及其制備方法，屬于微生物領(lǐng)域。針對(duì)目前牛分支桿菌ESAT?6可溶性蛋白制備方法復(fù)雜的問(wèn)題，本發(fā)明將牛分支桿菌ESAT?6基因，插入到pNC?HisE載體中，得到ESAT?6?pNC?HisE表達(dá)載體，并將ESAT?6?pNC?HisE表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中，得到含ESAT?6?pNC?HisE表達(dá)載體的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌，然后將上述陽(yáng)性枯草芽孢桿菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，取菌液加入TM培養(yǎng)基，不需誘導(dǎo)，33～37℃培養(yǎng)48～64h，將菌液離心取上清，經(jīng)純化后獲得牛分支桿菌ESAT?6蛋白。本發(fā)明可用于制備ESAT?6可溶性蛋白。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種牛分支桿菌ESAT-6蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)

早期分泌型蛋白ESAT-6是牛分支桿菌的主要免疫優(yōu)勢(shì)抗原，主要在牛分支桿菌感染早起分泌表達(dá)的一種抗原；卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是可用于防治結(jié)核病的減毒活疫苗，使用活的無(wú)毒牛型結(jié)核桿菌(Mycobacterium bovis)制成，有足夠高的免疫原性，可在一定程度上預(yù)防結(jié)核，但免疫動(dòng)物后效果不穩(wěn)定，動(dòng)物機(jī)體接種BCG后會(huì)對(duì)皮內(nèi)結(jié)核菌素反應(yīng)的特異性產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此用PPD皮試無(wú)法將疫苗接種與自然感染區(qū)分開來(lái)，但是卡介苗具有ESAT-6基因缺失，不能表達(dá)該蛋白，這一特征使其在牛分支桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病早期診斷中有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)目前牛分支桿菌ESAT-6可溶性蛋白制備方法復(fù)雜的問(wèn)題，提供了一種枯草芽孢桿菌表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白及其制備方法。

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白是通過(guò)以下方法制備得到的：將牛分支桿菌ESAT-6基因，插入到pNC-HisE載體中，得到ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體，并將ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中，得到含ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌，然后將上述陽(yáng)性枯草芽孢桿菌單菌落經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種到TM培養(yǎng)基，無(wú)需誘導(dǎo)，獲得的菌液經(jīng)純化后得到融合表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白，所述牛分支桿菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。

優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌在LB培養(yǎng)基中30～37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后取菌液按1％的體積比例加入TM培養(yǎng)基，33～37℃培養(yǎng)48～64h，將菌液離心取上清，經(jīng)純化后獲得融合表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白。

優(yōu)選地，所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌B.subtilis RIK1285。

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白的制備方法，包括如下步驟：

1)通過(guò)PCR方法獲得牛分支桿菌ESAT-6基因序列，將其連接到pNC-HisE載體中，得到ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體；所述牛分支桿菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示；

2)將ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌中，在30～37℃培養(yǎng)16～20h后，得到含ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌；

3)將含ESAT-6-pNC-HisE表達(dá)載體的陽(yáng)性枯草芽孢桿菌的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，30～37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.6～0.8，取菌液按1％的體積比例加入TM培養(yǎng)基中，無(wú)需誘導(dǎo)，33～37℃培養(yǎng)48～64h，離心取上清，并對(duì)上清進(jìn)行純化，得到融合表達(dá)的牛分支桿菌ESAT-6蛋白。

進(jìn)一步地，步驟1)所述PCR方法用的模板為患肺結(jié)核病鹿的肺臟組織DNA，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。