[發明專利]一種枯草芽孢桿菌表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810189596.2
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108409843A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 李海濤;苗利光;谷晨晨;劉艷環;張斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所;石家莊市獸用生物制品供應站
• 主分類號: C07K14/35
• 分類號: C07K14/35;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種枯草芽孢桿菌表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述ESAT-6蛋白是通過以下方法制備得到的：將牛分支桿菌ESAT-6基因，插入到pNC-HisE載體中，得到ESAT-6-pNC-HisE表達載體，并將ESAT-6-pNC-HisE表達載體轉化入枯草芽孢桿菌中，得到含ESAT-6-pNC-HisE表達載體的陽性枯草芽孢桿菌，然后將上述陽性枯草芽孢桿菌單菌落經LB培養基培養后，接種到TM培養基，無需誘導，獲得的菌液經純化后得到融合表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白，所述牛分支桿菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌在LB培養基中30～37℃培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后取菌液按1％的體積比例加入TM培養基，33～37℃培養48～64h，將菌液離心取上清，經純化后獲得融合表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白。

3.根據權利要求1或2所述的一種枯草芽孢桿菌表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌B.subtilis RIK1285。

4.一種權利要求1或2所述的枯草芽孢桿菌表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)通過PCR方法獲得牛分支桿菌ESAT-6基因序列，將其連接到pNC-HisE載體中，得到ESAT-6-pNC-HisE表達載體；所述牛分支桿菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示；

2)將ESAT-6-pNC-HisE表達載體轉化入枯草芽孢桿菌中，在30～37℃培養16～20h后，得到含ESAT-6-pNC-HisE表達載體的陽性枯草芽孢桿菌；

3)將含ESAT-6-pNC-HisE表達載體的陽性枯草芽孢桿菌的單菌落接種于LB培養基中，30～37℃培養至OD₆₀₀＝0.6～0.8，取菌液按1％的體積比例加入TM培養基中，無需誘導，33～37℃培養48～64h，離心取上清，并對上清進行純化，得到融合表達的牛分支桿菌ESAT-6蛋白。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述PCR方法中用的模板為患肺結核病鹿的肺臟組織DNA，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列如SEQ IDNO.3所示。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述PCR獲得的牛分支桿菌ESAT-6基因經BamHI與EcoRI雙酶切后與經同樣酶切后的pNC-HisE載體DNA進行連接。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述枯草芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌B.subtilis RIK1285。

8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)所述純化是利用HisTrap FFCrude柱純化進行的，具體是指用含有10mM咪唑的柱結合液洗3～5CV，再用含500mM咪唑的柱洗脫液洗脫獲得ESAT-6蛋白。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述柱結合液配方為：20mM磷酸鈉、500mM氯化鈉和10mM咪唑，pH7.4；柱洗脫液配方為：20mM磷酸鈉、500mM氯化鈉和500mM咪唑，pH7.4。

10.一種表達牛分支桿菌ESAT-6蛋白的枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌含有ESAT-6-pNC-HisE表達載體，所述ESAT-6-pNC-HisE表達載體是由牛分支桿菌ESAT-6基因，經BamHI與EcoRI雙酶切后，與經同樣酶切的pNC-HisE載體大片段連接獲得的，所述牛分支桿菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。