[發明專利]蠶蛹蛋白多肽的制備方法

有效

• 申請號: 201810189548.3
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108396049B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 陳貴才;王賢玉;徐天華;吳中華;張麗佳;聶月美;劉柳;曹春華;周曉紅;張小朋;余有龍
• 申請（專利權）人: 浙江匯能生物股份有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/14;C07K1/16;C07K1/18
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 李笑磊

1.蠶蛹蛋白多肽的制備方法，包括蠶蛹粉預處理、蠶蛹蛋白粉酶解、蠶蛹蛋白多肽粗液制備、離子交換樹脂層析、凝膠柱層析、高效液相色譜純化，其特征在于：所述高效液相色譜純化步驟為：將凝膠層析酶解物溶解，利用高效液相色譜進行純化，即得蠶蛹蛋白多肽；

所述高效液相色譜純化步驟中酶解物溶液的濃度為80-100μg/mL，所述色譜條件為：設置進樣量為4-6μL，色譜柱為尺寸250mm×4.6mm、粒徑5μm的Agilent C18，柱溫為25-35℃、流動相為10-15%乙腈溶液、洗脫速度為0.8-1.2mL/min；

所述高效液相色譜純化步驟中乙腈溶液中含有0.05-0.07%三氟乙酸和0.003-0.005%的薄荷醇；

所述高效液相色譜純化步驟中高效液相色譜分離填料為改性介孔硅膠，所述改性介孔硅膠中2-巰基-1-甲基咪唑和2-巰基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶聯密度為90-110μmol/g和30-50μmol/g。

2.根據權利要求1所述的蠶蛹蛋白多肽的制備方法，其特征在于：所述蠶蛹粉預處理步驟為：按料液比為1:5-8g/mL向蠶蛹粉中加入體積比為1:1-2的正己烷和石油醚混合液，加熱回流4-5h，即得蠶蛹蛋白。

3.根據權利要求1所述的蠶蛹蛋白多肽的制備方法，其特征在于：所述蠶蛹蛋白粉酶解步驟為：按料液比為1:20-25g/m向蠶蛹蛋白粉中加入蒸餾水，混合均勻，調節pH至7.5-8.5，然后加入堿性蛋白酶和中性蛋白酶，隨后在50-60℃下酶解5-7h，然后將溫度升至90-100℃，保溫10-20min進行滅酶，冷卻后在溫度為1-5℃、轉速為8000-10000rpm的離心機中離心8-10min，上清液濃縮至濃度為45-55mg/mL的溶液，即為蠶蛹蛋白多肽粗液。

4. 根據權利要求1所述的蠶蛹蛋白多肽的制備方法，其特征在于：所述離子交換樹脂層析步驟為：將蠶蛹蛋白多肽粗液加入到DEAE-52陰離子交換樹脂層析柱，依次用雙蒸水、0.1M、0.5M和1M的NaCl溶液洗脫，收集對ACE抑制活性最好的蛋白多肽，即為離子交換層析酶解物。

5.根據權利要求1所述的蠶蛹蛋白多肽的制備方法，其特征在于：所述凝膠柱層析步驟為：將離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為20-30mg/mL的溶液，離心，上清液經過葡聚糖凝膠柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據280nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，所述凝膠柱層析步驟中設置檢測器靈敏度為0.2A，檢測器調至280nm處檢測，進樣量1.8-2.2mL，流速為0.5-0.8mL/min。