[發(fā)明專利]一種定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的熒光微球檢測卡

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810189187.2
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號: CN108445217B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武玉香;唐世云;沈志強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 山東綠都生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/573;G01N33/558
• 代理公司: 寧波甬致專利代理有限公司 33228
• 代理人: 李迎春

本發(fā)明涉及一種定量檢測牛奶中β?內(nèi)酰胺酶殘留的熒光微球檢測卡及其制備方法，具體步驟為：（1）抗β?內(nèi)酰胺酶配對單克隆抗體的制備，包括免疫程序、細(xì)胞融合、雜交瘤篩選及克隆化、抗體制備及純化；（2）β?內(nèi)酰胺酶殘留的熒光微球定量檢測檢測卡及其制備方法，包括熒光微球抗β?內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的制備、微球墊處理、噴膜、C，T線確定、性能測定。本發(fā)明檢測牛奶中β?內(nèi)酰胺酶殘留的最低檢測限為1×10^?6U/mL(U/g)，并且牛奶樣本直接檢測，無需任何樣本處理過程，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測牛奶中β?內(nèi)酰胺酶殘留。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域以及食品安全定量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種半定量快速定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的熒光微球定量檢測檢測卡及其制備方法。

背景技術(shù)

β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素的酶。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對(β-內(nèi)酰胺類)抗菌藥物耐藥最常見的機(jī)制，廣泛地涉及到許多社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌，在各種耐藥機(jī)制中占80%。β-內(nèi)酰胺酶因可以分解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素，掩蓋抗生素痕跡，故被列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)》名單，中國不允許在牛奶中添加。

目前，定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的方法，包括微生物法、碘量法、頭孢菌素顯色法、酸度法和高效液相色譜法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-MS/MS)定量檢測方法利用活性β-內(nèi)酰胺酶能夠酶解青霉素族藥物的特性，在原乳中加入適量氨芐青霉素，酶解1h后，定量檢測原乳中氨芐青霉素酶解率，定性定量檢測活性目標(biāo)物。試樣中氨芐青霉素經(jīng)乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱凈化和濃縮后，RRLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式定性與定量分析，該方法對活性β-內(nèi)酰胺酶檢出限為4U/mL。牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的檢測方法改進(jìn)有Charm試劑盒，結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺酶在快速檢測法中的最低檢出限為1.5×10^-4～1.6×10^-3U/mL(U/mL)。發(fā)明專利申請CN201310001684.2公開了一種檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的雙抗體夾心法，應(yīng)用重組β-內(nèi)酰胺酶免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)過正常的免疫、細(xì)胞融合、篩選后得到15株β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，15株單克隆抗體分別標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）并進(jìn)行兩兩配對，以JN2011-03、JN2011-04分別為包被抗體和酶標(biāo)抗體，以β-內(nèi)酰胺酶為標(biāo)準(zhǔn)品建立了β-內(nèi)酰胺酶的夾心ELISA分析方法，LOD為1.22ng/mL，線性范圍為10-100ng/mL。發(fā)明專利CN201310293739.1公開了一種定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的試劑盒，包含包被有青霉素結(jié)合蛋白的酶標(biāo)板、標(biāo)記物偶聯(lián)β-內(nèi)酰胺類抗生素、底物對照1為β-內(nèi)酰胺類抗生素濃度為0ppb的脫脂奶粉凍干品、底物對照2為含標(biāo)定濃度β-內(nèi)酰胺類抗生素的脫脂奶粉凍干品、β-內(nèi)酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，所述試劑盒具有良好的特異性和靈敏性，可檢出大約0.5U/ml濃度的β-內(nèi)酰胺酶，線性檢出范圍為1U/ml～16U/ml。發(fā)明專利申請CN201110162413.6公開了一種用于檢測原料乳及乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測裝置及其檢測方法，包括檢測試紙條、標(biāo)準(zhǔn)比色卡；標(biāo)準(zhǔn)比色卡由9個(gè)色塊組成，從淺到深分別對應(yīng)于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-內(nèi)酰胺酶濃度；檢測試紙條由過濾層、顯色層、吸水材料層和基板組成，以2,2'-聯(lián)喹啉乙醇溶液作為顯色劑和CuSO₄作為絡(luò)合劑制備而成，根據(jù)待測樣品顯色程度與標(biāo)準(zhǔn)比色卡的對比，快速判定β-內(nèi)酰胺酶的含量范圍。

以上定量檢測方式均存在檢測時(shí)間長，有的需要大型儀器輔助測試，檢測費(fèi)用高等缺點(diǎn)。本研究利用免疫微球定量檢測原理，研制出一種新型的快速定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的熒光微球檢測卡及其制備方法，為快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留減少了時(shí)間和成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的檢測卡及其制備方法，本發(fā)明為快速、靈敏、準(zhǔn)確的定量檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留減少了時(shí)間和成本，并提升了靈敏度。