[發(fā)明專利]一種用于預(yù)防HPV感染的核酸疫苗

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810186917.3
• 申請日: 2018-03-07
• 公開（公告）號: CN108424926A
• 公開（公告）日: 2018-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龐以芹;謝亦武;吳必杰;魏勇
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇潤潔生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種HPV L1微環(huán)DNA疫苗及其在預(yù)防HPV感染的應(yīng)用。本發(fā)明的HPV L1微環(huán)DNA中包含HPV16亞型的L1(主要衣殼蛋白)的核苷酸序列。同時，本發(fā)明采用的微環(huán)DNA具有以下優(yōu)點：1)不整合入宿主細胞基因組，不會誘發(fā)新的突變，較病毒載體更為安全；2)可在工程細菌內(nèi)大量擴增，制備工藝簡單，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本低；3)表達外源基因較傳統(tǒng)質(zhì)粒穩(wěn)定，高效。本發(fā)明的HPV L1微環(huán)DNA用于制備疫苗對于宮頸癌的預(yù)防有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種HPV L1微環(huán)DNA疫苗及其制備方法，以及在預(yù)防HPV感染的應(yīng)用。

背景技術(shù)

宮頸癌占女性婦科惡性腫瘤的第二位，現(xiàn)已成為威脅女性健康的重要疾患，中國每年死于宮頸癌的人數(shù)將近5萬，宮頸癌的病因研究一直為國內(nèi)外學(xué)者所重視，研究發(fā)現(xiàn)引起宮頸癌的關(guān)鍵是HPV的感染。HPV屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是球形、雙鏈環(huán)狀DNA病毒。HPV主要通過直接或間接接觸污染物品或通過性傳播感染人類。HPV的感染有宿主特異性和組織特異性，只能感染人類的皮膚和粘膜受損的基底細胞。

HPV至今已鑒定明確的大約有200多個亞型，根據(jù)其致病和預(yù)后不同又可分為高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV 15種，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病變和宮頸癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。HPV 16型和HPV 18型可導(dǎo)致約70％的宮頸癌病例、80％的肛門癌、60％的陰道腫瘤和40％的外陰癌。只有持續(xù)的HR-HPV的感染才是宮頸癌的主要因素。

HPV L1衣殼蛋白是人乳頭瘤病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,是病毒感染細胞和細胞免疫反應(yīng)攻擊病毒的主要靶位，且該蛋白較為保守。因此可以針對L1蛋白開發(fā)預(yù)防/治療宮頸癌的藥物。

DNA疫苗，是將外源目的基因構(gòu)建于真核表達載體，可直接注射到動物體內(nèi)的第三代疫苗。其使外源基因在活體內(nèi)表達，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。

基因載體的選擇對DNA疫苗的構(gòu)建至關(guān)重要，一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的骨架DNA成分均包括DNA復(fù)制起始位點、抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止子等，某些成分會抑制目的基因表達，并且載體基因DNA可能插入宿主基因組，誘發(fā)插入突變和基因沉默的危險；另一方面，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，目的基因只能實現(xiàn)瞬間表達，其分子量較大，容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機體所清除。因此，安全高效的表達是研究核酸DNA疫苗基因治療的關(guān)鍵。

近年開發(fā)的微環(huán)DNA載體(MC)技術(shù)有助于解決以上問題。微環(huán)DNA是親本質(zhì)粒(parentalplasmid，PP)體內(nèi)位點特異性重組的產(chǎn)物。在攜帶真核表達框的親本質(zhì)粒兩側(cè)插入重組酶識別位點，誘導(dǎo)體內(nèi)相關(guān)重組酶表達，該重組酶將識別位點中間的DNA序列切斷，親本質(zhì)粒被分成2個超螺旋分子，即具有復(fù)制功能的小質(zhì)粒(miniplasmid，MP)和攜帶真核表達框的微環(huán)(minicircle，MC)DNA。

微環(huán)DNA是傳統(tǒng)質(zhì)粒在大腸桿菌中通過位點特異性重組得到的一種新穎的小環(huán)超螺旋表達框，其缺乏抗性標(biāo)記基因、復(fù)制原點等細菌序列，增強了在臨床應(yīng)用上的安全性，可在體內(nèi)長期表達高水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。MC在結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)基因表達的持久性、細胞內(nèi)的穩(wěn)定性上，與共價鍵密閉環(huán)狀DNA(cccDNA)相同，使MC成為安全、高效的理想載體。

與傳統(tǒng)質(zhì)粒和病毒載體比較，微環(huán)DNA在哺乳動物細胞內(nèi)表達外源基因具有一系列獨特的優(yōu)勢：1)不整合入宿主細胞基因組，不會誘發(fā)新的突變，較病毒載體更為安全；2)可在工程細菌內(nèi)大量擴增，制備工藝簡單，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本低；3)去除了傳統(tǒng)質(zhì)粒中的抑制信號，表達外源基因較傳統(tǒng)質(zhì)粒穩(wěn)定，高效。

目前預(yù)防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效預(yù)防HPV感染，其屬于蛋白疫苗，成本較高，故有必要開發(fā)預(yù)防HPV感染的核酸疫苗。尚無針對HPV L1殼蛋白的預(yù)防宮頸癌的微環(huán)DNA疫苗。