[發明專利]用于鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR引物和方法

有效

• 申請號: 201810183442.2
• 申請日: 2018-03-06
• 公開（公告）號: CN108179207B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 楊玉文;趙廷昌;喬培;張曉曉;白雪;關巍;季葦芹
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

1.用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR引物組，其特征在于，包括正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2，其核苷酸序列如下：

BFB：5’-ATGAAGCGTACTGTTCAG-3’，

BFB1：5’-ACCATCGATATTAGCATC-3’，

BFB2：5’-TTAAGGAGCAAACGTGC-3’；

所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2在PCR反應體系中的濃度配比為BFB︰BFB1︰BFB2＝1～2︰1︰1。

2.用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR引物組。

3.根據權利要求2所述的PCR試劑盒，其特征在于，所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2為液態或固態粉末狀，和/或所述正向引物BFB和反向引物BFB1、BFB2分別獨立包裝或混裝。

4.根據權利要求2或3所述的PCR試劑盒，其特征在于，還包括PCR反應所需的其它通用試劑以及試劑盒使用說明書。

5.權利要求1所述的用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR引物組或權利要求2～4任一所述的用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR試劑盒在鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌中的應用。

6.用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)獲得待測病菌的菌液或基因組DNA；

(2)以所述待測病菌的菌液或基因組DNA為模板，采用權利要求1所述的用于一步鑒定不同亞組瓜類細菌性果斑病菌的PCR引物組進行PCR反應，得到擴增產物；

(3)凝膠電泳檢測擴增產物，若擴增產物中出現348bp的條帶，則所述待測病菌為瓜類細菌性果斑病菌I組菌株；若擴增產物中出現507bp的條帶，則所述待測病菌為瓜類細菌性果斑病菌II組菌株。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的體系為：KOD-Plus-Neo10×PCR緩沖液2.5μl，25mM MgSO₄ 1.5μl，2mM dNTPs 2.5μl，10mM引物BFB/BFB1/BFB2各0.5μl，1.0U/μl KOD Plus Neo酶0.5μl，模板DNA或菌液0.5μl，滅菌雙蒸水補足25μl。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反應的條件為：94℃2min；94℃15sec，52℃30sec，68℃45sec，30個循環；68℃延伸2min。

9.根據權利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述獲得待測病菌的菌液包括如下步驟：將單粒種子放入2ml的離心管中，加入1ml ddH₂O，180r/min振蕩培養30min，取培養上清液。