[發明專利]接枝共聚制備大腸桿菌檢測膜及細菌檢測的方法

在審

• 申請號: 201810178378.9
• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108646017A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 王棟;魯振坦;余振國;張佳琪;王雯雯
• 申請（專利權）人: 武漢紡織大學
• 主分類號: G01N33/532
• 分類號: G01N33/532;G01N21/64
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馬輝

本發明公開了一種接枝共聚制備大腸桿菌檢測膜及細菌檢測的方法，屬于生物檢測技術領域。該制備方法為以納米纖維膜為基材層在其表面通過原子轉移自由基聚合接枝引入甘露糖聚合物，然后再與功能化異硫氰酸熒光素復合反應，制備得到大腸桿菌檢測膜，其中，功能化異硫氰酸熒光素為異硫氰酸熒光素與牛血清蛋白的反應物。該檢測膜只對大腸桿菌進行特異性設別，方便快速準確的檢測大腸桿菌。

技術領域

本發明涉及大腸桿菌的檢測，屬于生物檢測技術領域，具體地涉 及一種接枝共聚制備大腸桿菌檢測膜及細菌檢測的方法。

背景技術

大腸桿菌是人和動物腸道內最常見的一種細菌，主要通過受污染 的食品進行傳播，例如生鮮奶和生的或者未煮熟的肉制品類，受糞便 污染的水或者其它食物及食物制備期間的交叉感染也將導致感染。大 多數大腸桿菌是不致病的，少數具有毒性，可引起疾病，如腸出血性 大腸桿菌，在小兒中常常導致溶血性尿毒綜合癥，威脅生命。然而大 腸桿菌對熱的抵抗力較其他腸道桿菌強，55℃經60分鐘或60℃加熱 15分鐘仍有部分細菌存活。國家規定，每毫升飲用水中的菌落總數小 于100，每100毫升水中不得檢出總大腸菌群。

對大腸桿菌的檢測，通常采用瓊脂平板培養計數法，但是共需 2～3d才能完成，這種方法費時且工序繁雜。生物傳感器作為近年來興 起的快速檢測食品品質的方法，其采用固定化生物活性物質作為催化 劑，結合使用價值昂貴的試劑，耗時少，準確度較高，缺點是成本也 較高。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明公開了一種方便快速準確檢測大腸 桿菌濃度的接枝共聚制備大腸桿菌檢測膜及細菌檢測的方法。

為實現上述目的，本發明公開了一種接枝共聚制備大腸桿菌檢測 膜的方法，它包括如下步驟：

a)制備表面活化的納米纖維膜層：取納米纖維膜浸漬于氫氧化鈉 溶液中活化處理得到表面活化的納米纖維膜；

b)制備表面具有引發原子轉移自由基的納米纖維膜：取步驟a) 得到的所述表面活化的納米纖維膜與溴異丁酰溴反應得到表面具有 引發原子轉移自由基的納米纖維膜；

c)制備表面接枝甘露糖聚合物的納米纖維膜：取步驟b)得到的 所述表面具有引發原子轉移自由基的納米纖維膜與甘露糖單體發生 接枝共聚反應，制備得到表面接枝甘露糖聚合物的納米纖維膜；

d)制備異硫氰酸熒光素的牛血清蛋白溶液；

e)制備大腸桿菌檢測膜：取步驟c)得到的所述表面接枝甘露糖 聚合物的納米纖維膜浸漬于步驟d)的所述異硫氰酸熒光素的牛血清 蛋白溶液中，制備得到大腸桿菌檢測膜。

進一步優選的，所述步驟c)的具體反應過程如下：

所述表面具有引發原子轉移自由基的納米纖維膜與溴化亞銅混 合后，在惰性氣體環境中，與甘露糖單體、二聯吡啶的甲醇混合液， 在80℃的恒溫水浴下振蕩反應10～20h，制備得到表面接枝甘露糖聚 合物的納米纖維膜。

再進一步優選的，所述步驟c)中，所述溴化亞銅與甘露糖單體、 二聯吡啶之間的物質的量之比為0.5～2:50～200:0.5～2。

更進一步優選的，所述步驟d)的異硫氰酸熒光素的牛血清蛋白 溶液的制備過程如下：

取異硫氰酸熒光素和牛血清蛋白混合后置于水中，所述異硫氰酸 熒光素與牛血清蛋白的質量比為4～8:100，控制溫度為4℃，攪拌反 應4～6h，去除未反應完全的異硫氰酸熒光素后調節溶液的pH為7～9， 得到被異硫氰酸熒光素標記的牛血清蛋白水溶液。

更進一步優選的，所述步驟e)的具體反應過程如下：取步驟c) 得到的所述表面接枝甘露糖聚合物的納米纖維膜浸漬于步驟d)的所 述異硫氰酸熒光素的牛血清蛋白溶液中，控制溫度為4℃，反應 10～20min，取出，采用清水洗滌至少2次，干燥后制備得到大腸桿菌 檢測膜。