[發明專利]一種狂犬病毒顆粒的純化方法

有效

• 申請號: 201810177437.0
• 申請日: 2018-03-02
• 公開（公告）號: CN108531464B
• 公開（公告）日: 2019-04-23
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 廣州瑞貝斯藥業有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛;鄭瑩

本發明公開了一種狂犬病毒顆粒的純化方法，包括將病毒液進行次序可互換的陰離子交換層析和羥基磷灰石層析。本發明方法的有益效果在于：狂犬病毒液的前處理工藝要求低，不會對狂犬病毒顆粒造成二次破壞，可以在不調整工藝條件的情況下，處理各種培養基質培養得到的病毒液，處理量大，處理成本低；提高了狂犬病毒顆粒的結構均一性，通過離子交換層析和羥基磷灰石層析，可將目標病毒顆粒與分子量接近但結構異常的病毒顆粒有效分離。

技術領域

本發明屬于病毒生物學技術領域，具體涉及一種狂犬病毒顆粒的純化方法。

背景技術

狂犬病毒是一種包膜病毒，結構復雜且變化較大，因此，獲得純度高、結構均質的狂犬病毒顆粒非常困難。

狂犬病毒顆粒由一條單鏈RNA分子(約11930個核苷酸)和5種蛋白質構成，其中，20～150個L蛋白、950個P蛋白和單鏈RNA組成結構穩定的核衣殼，核衣殼外包裹來源于宿主細胞的雙層脂質膜，核衣殼與脂質膜之間添充了1650個M蛋白；脂質膜表面插入了不同數量的G蛋白，G蛋白上連接了不同數量和不同長度的糖鏈。G蛋白的數量和糖基化程度對病毒顆粒的生物學特性和免疫學特性具有重大影響。

目前狂犬病毒培養所用培養基質包括小鼠腦、雞胚、鴨胚、地鼠腎原代細胞、雞胚原代成纖維細胞病毒、人二倍體細胞和Vero細胞等，無論使用何種培養基質，狂犬病毒收獲液都是一個成分復雜的混合物體系。其包括各種結構的狂犬病毒顆粒及各種雜質。

完整的狂犬病毒顆粒大小約75×180nm，分子量5～8×10⁸，沉降系數600S，在蔗糖溶液中的浮力密度1.14～1.17g/ml。脫落細胞直經約5μm，大部分細胞碎片直經在0.8μm以上，均明顯大于病毒顆粒；大部分宿主細胞蛋白質、糖類、脂類和RNA(主要是tRNA和rRNA)分子量在1000KD以下，均明顯小于病毒顆粒(mRNA分子量較大，但極不穩定，在收獲液中含量微少)；宿主細胞DNA則包含了大于、小于和相當于病毒顆粒大小的系列組分；產品相關雜質也是大小不均的系列組分，包括大于(病毒聚團)、小于(病毒裂解、破碎、未裝配成病毒顆粒的亞單位大分子)及相當于有效成分大小(病毒顆粒大小接近但G蛋白拷貝數低、糖基化異常，免疫原性低，故一般列為雜質)的各種成分。

目前，狂犬病毒的分離原理主要是利用分子量大小差異將病毒顆粒和雜質分離。分離技術路線主要包括：密度梯度超速離心純化技術和凝膠過濾柱層析純化技術。由于病毒收獲液中部分大分子雜質的分子篩性質與有效成分非常接近，單純依靠分子篩原理很難進行有效分離。這類雜質包括：

(1)來源于宿主細胞的高分子量蛋白質。培養過程中宿主細胞表達的蛋白質數量在2萬種以上，分子量大小不均，許多蛋白質以多聚體形式存在。因此，病毒收獲液中的宿主細胞蛋白質(HCP)是一個組成復雜的混合物，其中包括分子篩性質與病毒粒子接近的組分。

(2)來源于宿主細胞的DNA。病毒收獲液中游離的DNA是通過宿主細胞的破碎、病變、壞死或凋亡產生的，這些細胞生物學過程都會產生基因組DNA被剪切成大小不同片段的結果。因此，病毒收獲液中的宿主細胞DNA也是一個分子量大小高度不均一的混合物。一些工藝步驟如超濾濃縮產生的剪切效應還會進一步增加DNA分子量大小的不均一性。一部分DNA組分的分子篩性質與病毒粒子非常相近。

(3)來源于培養基添加物如牛血清，牛血清也是一種成分復雜的混合物。

(4)來源于狂犬病毒的結構衍生物。病毒培養過程中，通常會產生一部分結構不完整的病毒粒子，如G蛋白拷貝數過低、糖基化缺失或不完全的病毒。這些結構不完整的病毒粒子與結構完整的病毒粒子在生物學性質和免疫學性質等方面有顯著差別，但其分子篩性質與結構正常的病毒粒子十分接近，不易分離。

基于以上原因，現有的狂犬病毒顆粒純化方法很難將狂犬病毒顆粒和其他雜質有效分離，更難做到將結構不同或異常的狂犬病毒顆粒分離。