[發明專利]一種核酸測序文庫及其構建方法

有效

• 申請號: 201810176919.4
• 申請日: 2018-03-04
• 公開（公告）號: CN110219054B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 朱修銳;袁國紅;孟凡琳;郭永;王勇斗
• 申請（專利權）人: 清華大學;北京羿賽生物科技有限公司
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種用于核酸測序的文庫及其構建方法，所述構建方法包括對待測序的核酸進行片段化，片段化核酸進行轉錄擴增，擴增產物與接頭連接，和對連接后的產物進行擴增。通過該方法構建的測序文庫能夠在測序結果處理的過程中使用文庫構建過程中加上的已知序列和隨機序列對測序過程中每一個由核酸合成或擴增的反應產生的錯誤進行分類和修正，并精確確定待測序核酸序列中每種序列的分子數量和用于測序的擴增反應之前每種序列的分子數量或比例。

技術領域

本發明涉及核酸測序領域，尤其涉及一種用于核酸測序文庫及其構建方法。

背景技術

測序技術是一種能夠測定未知核酸序列的技術，獲取未知核酸的序列是進一步研究和改造基因，以及探討基因功能的基礎。近年來，測序技術在通量上大為提高，在成本上大幅降低，已成為研究未知基因組、轉錄組、表觀遺傳組和分子標志物等的利器。

雖然測序技術在通量和成本上的進展令人矚目，但是目前測序技術在準確性和定量性兩方面還有進一步改進的空間。在準確性方面，根據目前已商業化的技術，測序技術的最低總體錯誤率約為1E-7，以人的全基因組(約3E9個堿基)為例，這意味著在人的全基因組測序結果中，將有約300個堿基會發生錯誤，這些錯誤與全基因組上真正的單堿基突變位點混合在一起，將極大地影響到單堿基突變檢測的準確性，阻礙對基因功能等領域的研究和探索；在定量性方面，根據目前已商業化的技術，在測序之前一般需要進行指數擴增反應(比如聚合酶鏈反應)，指數擴增對不同序列的偏向性會隨著擴增過程迅速累積(2.0^40＝1.1E12,1.9^40＝1.4E11，擴增效率上10％的差異會導致經過40個循環的指數擴增后產物上約800％的差異)，從而使得測序結果中每種序列的數量比例難以反映用于測序的每種序列的數量比例，這種由于擴增造成的核酸分子數量比例的失真，使測序技術難以檢測到基因拷貝數的微小變化(0.2～5倍)，阻礙對基因調控等領域的研究和探索。

近年來，有許多研究工作在提高測序技術的準確性或定量性方面做出了努力和貢獻。雙重測序技術在一個步驟中帶有隨機序列的接頭連接到待測核酸序列兩端，將測序技術的精度提高了約10000倍，但是雙重測序技術的帶有隨機序列的接頭沒能有效地消除指數擴增造成的核酸分子數量比例的失真，因此在DNA拷貝數精確定量等方面的應用受到限制。基于液滴微流控的測序技術(Drop-seq)在RNA的3’端連接了一種用于標識樣本的隨機序列和一種用于標識RNA分子的隨機序列，雖然后者指示了每個RNA的分子來源，從而能實現RNA拷貝數的精確定量，但是在隨后的片段化過程中，RNA分子被打斷成多個片段，在RNA的3’端所加的隨機序列僅能指示RNA分子包含3’端的片段的分子來源，源于該RNA分子的其它片段在測序過程中出現的錯誤難以進行修正。基于液滴的多重鏈置換擴增(MDA)通過液滴限制了每個被擴增分子所能使用的公共資源(酶、引物、核苷酸等)，使擴增效率較高的序列提前將所占有的資源耗盡，而擴增效率較低的序列則可以慢慢消耗所占有的資源，有效地降低了擴增的偏向性(從試管內MDA反應的約0.1～20倍降低到液滴內MDA反應的約0.5～2倍)，但是基于液滴的MDA反應未引入任何修正擴增錯誤的機制，因此難以有效地消除MDA反應中產生的錯誤。基于轉座子插入的線性擴增技術(LIANTI)從擴增反應本身著手，將測序過程中使用的傳統指數擴增反應(比如聚合酶鏈反應)變為線性擴增技術，有效地降低了擴增的偏向性(約1.8～2.2倍)，但是LIANTI也未引入任何修正擴增錯誤的機制，因此也難以有效地消除LIANTI中產生的錯誤。

總之，目前的技術或只能有效地提高測序技術的準確性(雙重測序技術)，或只能有效地提高測序技術的定量性(Drop-seq、基于液滴的MDA和LIANTI)，難以使測序技術同時實現完全準確和精確定量這兩個目標。此外，無論目前的技術能否修正測序過程中的錯誤，它們都難以追溯所有這些測序讀數序列在每個步驟中的來源，以及測序過程中所產生的錯誤的來源，無法對改善測序技術的準確性提供指導意見。

發明內容