[發(fā)明專利]腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)建庫(kù)方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810176374.7
• 申請(qǐng)日: 2018-03-03
• 公開（公告）號(hào): CN108410969A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方圓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海渥恩生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 洪敏;謝緒寧

本發(fā)明公開了腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)建庫(kù)方法及應(yīng)用，該方法使用內(nèi)側(cè)引物對(duì)，采用多重PCR法進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物序列分別為DNA轉(zhuǎn)化的正鏈和負(fù)鏈，內(nèi)側(cè)引物5’端使用與外側(cè)引物3’端互補(bǔ)的20~25個(gè)堿基，3’端使用根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)外側(cè)的序列所設(shè)計(jì)的特異性引物序列，然后使用illumina Multiplexing PCR Primer 1.0為外側(cè)引物F和使用3’端截?cái)嗪蟮膇llumina RNA PCR Primer為外側(cè)引物R進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，從而構(gòu)建文庫(kù)。采用本方法可同時(shí)富集多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，所需樣本起始量超低，測(cè)序成本較低，通過(guò)雙鏈擴(kuò)增和二代測(cè)序分析，可剔除轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題導(dǎo)致的假陽(yáng)性，提高ctDNA檢出率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤基因甲基化檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)建庫(kù)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的腫瘤早期診斷包括了基于影像學(xué)的診斷、基于組織細(xì)胞層面的病理診斷和基于基因檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物診斷等手段。CT診斷的假陽(yáng)性較高，成本也較高，對(duì)病人有一定的傷害；組織細(xì)胞診斷，取樣較困難，病人較痛苦。

近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與某些基因的甲基化程度密切相關(guān)，且該甲基化在肺癌早期發(fā)生，并能特異性的反應(yīng)該癌種的腫瘤發(fā)生情況。通過(guò)檢測(cè)相關(guān)基因的甲基化程度，能夠在腫瘤發(fā)生初期較早的檢出腫瘤細(xì)胞的存在，從而為腫瘤的早期預(yù)防、治療提供幫助。

現(xiàn)在市場(chǎng)上已有的甲基化檢測(cè)方法有：甲基化特異性的PCR(MSP),亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BSP),高分辨率熔解曲線法(HRM),熒光探針PCR法，以及高通量測(cè)序法。其中除了高通量測(cè)序法，其余方法均只能間接檢測(cè)甲基化的程度，無(wú)法直觀的看到甲基化的具體情況，并且檢測(cè)的信息較少，無(wú)法整體評(píng)估該基因的甲基化情況,且每次只能檢測(cè)一個(gè)基因，無(wú)法準(zhǔn)確而全面的反饋出病人的全面信息。此外，由于血液游離DNA(cfDNA)含量極低，血液中游離循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的含量更低，約占cfDNA的0.1-1％，而普通甲基化全基因組高通量測(cè)序需要樣本起始量(30-100ng)較大，測(cè)序深度較淺，成本高，不能用于早期腫瘤病人的甲基化檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)建庫(kù)方法，采用該建庫(kù)方法可同時(shí)富集多個(gè)腫瘤相關(guān)基因，所需要的樣本起始量超低(10ng)，測(cè)序成本較低，且通過(guò)雙鏈擴(kuò)增和二代測(cè)序分析，可剔除轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題導(dǎo)致的假陽(yáng)性，提高ctDNA的檢出率。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供采用上述建庫(kù)方法所構(gòu)建的腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)文庫(kù)在高通量測(cè)序中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)建庫(kù)方法，包括以下步驟：

S1：從受檢樣本中提取DNA；

S2：對(duì)S1提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽化處理，得到轉(zhuǎn)化后的DNA，由于轉(zhuǎn)化后DNA序列不再互補(bǔ)，DNA呈現(xiàn)為解鏈狀態(tài)；

S3：使用內(nèi)側(cè)引物對(duì)，采用多重PCR法對(duì)S2的轉(zhuǎn)化后DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，使得擴(kuò)增的產(chǎn)物序列分別為DNA轉(zhuǎn)化的正鏈和負(fù)鏈；

S4：對(duì)S3獲得的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除非特異性擴(kuò)增的小片段DNA和二聚體；

S5：使用外側(cè)引物，對(duì)S4所得的純化產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增；

S6：對(duì)S5獲得的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，即得腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測(cè)文庫(kù)；

其中，S3中的內(nèi)側(cè)引物包括針對(duì)S2的甲基化的DNA的正、負(fù)鏈分別設(shè)計(jì)而成的兩對(duì)引物，每對(duì)內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補(bǔ)的20～25個(gè)堿基，3’端使用根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)外側(cè)的序列所設(shè)計(jì)的特異性引物序列；