[發(fā)明專利]腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測建庫方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810176374.7
• 申請日: 2018-03-03
• 公開（公告）號: CN108410969A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方圓
• 申請（專利權(quán)）人: 上海渥恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 洪敏;謝緒寧

1.腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測建庫方法，包括以下步驟：

S1：從受檢樣本中提取DNA；

S2：對S1提取的DNA進行亞硫酸鹽化處理，得到轉(zhuǎn)化后的DNA，由于轉(zhuǎn)化后DNA序列不再互補，DNA呈現(xiàn)為解鏈狀態(tài)；

S3：使用內(nèi)側(cè)引物對，采用多重PCR法對S2的轉(zhuǎn)化后DNA進行第一輪擴增，使得擴增的產(chǎn)物序列分別為DNA轉(zhuǎn)化的正鏈和負(fù)鏈；

S4：對S3獲得的第一輪擴增產(chǎn)物進行純化，去除非特異性擴增的小片段DNA和二聚體；

S5：使用外側(cè)引物，對S4所得的純化產(chǎn)物進行第二輪擴增；

S6：對S5獲得的第二輪擴增產(chǎn)物進行純化，即得腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測文庫；

其中，S3中的內(nèi)側(cè)引物包括針對S2的甲基化的DNA的正、負(fù)鏈分別設(shè)計而成的兩對引物，每對內(nèi)側(cè)引物的5’端使用與外側(cè)引物的3’端互補的20～25個堿基，3’端使用根據(jù)目標(biāo)靶點外側(cè)的序列所設(shè)計的特異性引物序列；

S5中的外側(cè)引物包括外側(cè)引物F和外側(cè)引物R，所述外側(cè)引物F與illuminaMultiplexing PCR Primer 1.0引物相同，所述外側(cè)引物R采用截斷了3’端的illumina RNAPCR Primer引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是：S3中，將所有內(nèi)側(cè)引物放入一個引物池中，在同一個反應(yīng)體系內(nèi)進行第一輪擴增，同時完成多個靶點基因的擴增。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的建庫方法，其特征是：所有內(nèi)側(cè)引物通過設(shè)計，使得其tm值差異范圍控制在±1℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建庫方法，其特征是：S3中進行第一輪擴增過程中，先富集原始模板，循環(huán)數(shù)控制5～10輪，其退火溫度與特異性引物的退火溫度一致；然后進行后續(xù)富集，使得退火溫度與內(nèi)側(cè)引物全長的tm值一致；退火時間均控制為1-2分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建庫方法，其特征是：所述受檢樣本為受檢者的活檢組織或其灌洗液。

6.一種如權(quán)利要求1-5任一所述的建庫方法所構(gòu)建的腫瘤相關(guān)基因甲基化檢測文庫在高通量測序中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是：所述高通量測序為illumina平臺測序。