[發明專利]一種橙皮苷的制備方法

在審

• 申請號: 201810171714.7
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108504680A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 李文云;徐娟;陳嘉景;袁子彧;彭昭欣;石梅艷;何珍玉;田靜
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;貴州省果樹科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/54;C12P19/60
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;李航

本發明公開了一種橙皮苷的制備方法，包括如下步驟：(1)構建1,6?鼠李糖基轉移酶基因的表達載體；(2)將步驟(1)中所構建的表達載體利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉入到愈傷組織中；(3)向步驟(2)所得的愈傷組織中加入橙皮素底物進行懸浮培養；(4)收集步驟(3)中所得懸浮細胞進行冷凍干燥后，并將所得干燥物溶于80％甲醇中混勻并進行離心，得到橙皮苷。本發明采用上述方法，利用工程細胞以橙皮素作為底物不斷的合成橙皮苷，其效率高，且分離純化簡單，同時能耗低，產物的純度高。

技術領域

本發明涉及一種橙皮苷的制備方法，尤其涉及一種利用工程細胞來合成橙皮苷的方法。

背景技術

橙皮苷是柑橘中一種主要的黃烷酮之一，是甜橙、寬皮柑橘、檸檬等非苦味柑橘果實中含量最豐富的一種黃烷酮糖苷，而在有苦味的柚果實中卻檢測不到(Rousef et al,1987；Gattuso et al.,2007；Frydman et al.,2013；Chen et al.,2015)。除了對果實風味的影響外，橙皮苷在抵御病蟲侵害方面也具有重要作用(Del Rio et al.,2004)。橙皮苷不僅對柑橘風味有重要影響，還具有廣泛的藥用價值，如在抗氧化、抗癌、抑菌、消炎、預防心腦血管等方面具有顯著作用。臨床常作為維生素類藥(Roohbakhsh et al,2014)，橙皮苷經苯丙烷代謝途徑合成，是橙皮素兩步糖基化后的鼠李糖苷。1,6-鼠李糖基轉移酶(1,6-RhaT)是第2步糖基化過程中的關鍵酶(Frydman et al,2013)。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于：在于提供一種利用工程細胞制備高純度橙皮苷的方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：一種橙皮苷的制備方法，包括如下步驟：(1)構建1,6-鼠李糖基轉移酶基因的表達載體；(2)將步驟(1)中所構建的表達載體利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉入到愈傷組織中；(3)向步驟(2)所得的愈傷組織中加入橙皮素底物進行懸浮培養；(4)將步驟(3)中所得懸浮細胞進行冷凍干燥后，并將所得干燥物溶于80％甲醇中混勻并進行離心，得到橙皮苷。

上述技術方案的有益效果在于：采用上述方法，利用工程細胞利用橙皮素作為底物不斷的合成橙皮苷，其效率高，且分離純化簡單，同時能耗低，產物的純度高。

上述技術方案中所述步驟(2)中愈傷組織的為煙草愈傷組織。

上述技術方案的有益效果在于：采用煙草愈傷組織作為感染載體，其感染效率高，培養方便。

上述技術方案中所述步驟(1)中1,6-鼠李糖基轉移酶基因構建方法包括如下步驟：

s1:設計并制備1,6-鼠李糖基轉移酶基因特異引物:

1,6-RhaT-F為SEQ ID NO.1,

1,6-RhaT-R為SEQ ID NO.2；

s2:采用PCR方法從甜橙、寬皮柑橘或檸檬果實的cDNA中擴增得到1,6-鼠李糖基轉移酶基因的序列全長；

s3:回收1,6-鼠李糖基轉移酶基因的序列后并與工程菌的質粒DNA連接；

s4:將上述工程菌轉化到感受態大腸桿菌菌株中；

s5:篩選陽性的大腸桿菌菌株進行增殖并提取質粒；

s6:將步驟s5中獲得的質粒利用GateWay試劑盒構建轉化載體，并測序，選擇陽性菌液提取質粒，所得質粒即為1,6-鼠李糖基轉移酶基因的表達載體。

上述技術方案的有益效果在于：其方便簡單。

上述技術方案中所述轉化載體為帶有潮霉素抗性標記的PHTWG2D。

上述技術方案的有益效果在于：便于檢測。