[發明專利]一種橙皮苷的制備方法

在審

• 申請號: 201810171714.7
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108504680A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 李文云;徐娟;陳嘉景;袁子彧;彭昭欣;石梅艷;何珍玉;田靜
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;貴州省果樹科學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/54;C12P19/60
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立;李航

1.一種橙皮苷的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)構建1,6-鼠李糖基轉移酶基因的表達載體；(2)將步驟(1)中所構建的表達載體利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉入到愈傷組織中；(3)向步驟(2)所得的愈傷組織中加入橙皮素底物進行懸浮培養；(4)收集步驟(3)中所得懸浮細胞進行冷凍干燥后，并將所得干燥物溶于80％甲醇中混勻并進行離心，得到橙皮苷。

2.根據權利要求1所述的橙皮苷的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中愈傷組織的為煙草愈傷組織。

3.根據權利要求1所述的橙皮苷的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中1,6-鼠李糖基轉移酶基因構建方法包括如下步驟：

s1:設計并制備1,6-鼠李糖基轉移酶基因特異引物:

1,6-RhaT-F為SEQ ID NO.1,

1,6-RhaT-R為SEQ ID NO.2；

s2:采用PCR方法從甜橙、寬皮柑橘或檸檬果實的cDNA中擴增得到1,6-鼠李糖基轉移酶基因的序列全長；

s3:回收1,6-鼠李糖基轉移酶基因的序列后并與工程菌的質粒DNA連接；

s4:將上述工程菌轉化到感受態大腸桿菌菌株中；

s5:篩選陽性的大腸桿菌菌株進行增殖并提取質粒；

s6:將步驟s5中獲得的質粒利用GateWay試劑盒構建轉化載體，并測序，選擇陽性菌液提取質粒，所得質粒即為1,6-鼠李糖基轉移酶基因的表達載體。

4.根據權利要求3所述的橙皮苷的制備方法，其特征在于，所述轉化載體為帶有潮霉素抗性標記的PHTWG2D。

5.根據權利要求3所述的橙皮苷的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌菌株為大腸桿菌Trans 5α菌株。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的橙皮苷的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中冷凍干燥時間為3d；離心時以4000g的離心力離心10min。