[發明專利]一種過表達COX5A轉基因鼠模型及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201810171251.4
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108396036B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 習楊彥彬;金華;陳波;張麗;王廷華;張連峰
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/89;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京權智天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11638
• 代理人: 張廷利

1.一種過表達COX5A轉基因鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、PCR克隆擴增目的基因COX5A(GeneID:12858)的開放讀碼框，目的片段386bp；

步驟2、pcDNA3.1(+)-m-COX5A質粒構建：經過酶切、DNA片段回收、連接反應用內切酶EcoRI與XhoI酶切pcDNA3.1(+/-)Vector載體和插入的目的片段COX5A的ORF；

步驟3、將構建好的質粒載體轉入菌種進行DNA的提取，通過大量制備質粒DNA，電泳、用QiagenDNA凝膠回收試劑盒回收DNA片段；

步驟4、用SephedexG50的凝膠柱純化DNA，用TE溶液對DNA進行溶解回收；

步驟5、回收片段，用于顯微注射，用0.22μm的濾膜過濾的TE顯微注射稀釋液稀釋DNA樣品，12000g，離心2小時，上清液的2/3進行分裝；

步驟6、將構建好的轉基因片段線性化，用顯微注射法制作轉基因小鼠；

步驟7、PCR法鑒定陽性轉基因鼠，轉基因小鼠在出生9-14天用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，利用特異引物通過PCR法進行檢測；PCR鑒定陽性者作為實驗組，陰性者作為同窩野生型對照；獲得表達386bp目的片段的COX5A過表達轉基因小鼠；

步驟8、運用RT-PCR及Western blot技術篩選出COX5A表達水平最高的品系，建立穩定的COX5A過表達小鼠模型；首建鼠合籠后得到數只F0代鼠，為排除不同插入位點對PDGF-BB表達的影響，運用RT-PCR及WB技術對F0代鼠產下的子代進行COX5A的基因和蛋白表達檢測，篩選出最高表達的品系，留種繁殖；獲得COX5A過表達轉基因F0代鼠。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟1.1中的擴增引物序列如下所示：

上游引物為5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物為5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟1.7中顯微注射法制作轉基因小鼠方法包含以下步驟：

a、超數促排卵操作，即第一天注射孕馬血清促性腺激素10IU/只，48小時后注射人絨毛膜促性腺激素10IU/只；同時，選取健康雄性6周C57BL/6小鼠與上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合籠交配，觀察陰栓情況，有陰栓的小鼠提出待用，即為供卵小鼠，備用；

b、取卵：將供卵小鼠麻醉后腹部向上放置，備皮暴露腹部，用剪刀和鑷子逐層分離皮膚、筋膜、肌肉，暴露卵巢、輸卵管和子宮，分離輸卵管，用鑷子將輸卵管放置到M2培養基中，解剖顯微鏡下打開輸卵管的壺腹部，使卵流到培養液里；向培養液里加入l mg/ml的透明質酸酶，并用M2培養基沖洗3-4遍，去除顆粒細胞；在顯微鏡下進行觀察，對受精卵與其他細胞進行鑒別，因受精卵排出第二極體，而未受精卵和其他變成異常形態的卵可以容易地進行區別；選好的受精卵，移到盛著M2培養基液滴的塑料皿中，移至二氧化碳孵箱中培養直到受精卵適合注射為止；

c.顯微注射：顯微注射法將線性化的轉基因載體片段注射到C57BL/6小鼠的受精卵雄性原核中，在顯微鏡下觀察，挑選細胞飽滿，透明帶清晰，雄原核清晰可見的受精卵待用；在載物玻片上作成有20個受精卵的培養液滴和轉基因載體片段溶液滴，固定到載物臺上，用持卵吸管將受精卵加以固定，玻璃吸管注入轉基因載體片段溶液滴，將其緩慢地注入雄性原核，注射完畢后收集受精卵，37℃二氧化碳培養箱中培養一夜；

d.移植：將假孕小鼠麻醉，手術取出卵巢連接輸卵管，用脂肪鑷固定，在顯微鏡下找到輸卵管開口，顯微鏡下，挑出分裂為兩細胞的受精卵，備用；吸取上述受精卵，將移植管口插入輸卵管口，輕輕將移植管內的液體吹入，看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個氣泡，即移植成功；將卵巢連同輸卵管放回腹腔，逐層縫合。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述的二氧化碳孵箱的溫度為37℃，含有5％二氧化碳，95％空氣。

5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述步驟7中的特異引物具體為：

上游引物為：5′GTCAATGGGTGGAGTATTTACG 3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

下游引物為：5′GCTTATATAGACCTCCCACCGT 3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。