[發明專利]一種銅綠假單胞菌的擴增引物組、應用及銅綠假單胞菌的檢測方法

在審

• 申請號: 201810170246.1
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108441540A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 趙帆;胡守奎;吳蕾;農金輕;高乃姝;朱曉雪;鄭鳳芝;王春梅;翟翼方;劉銘義;王靜;蔡煜;袁平
• 申請（專利權）人: 北京大學首鋼醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 馬苗苗

本發明提供了一種銅綠假單胞菌的擴增引物組、應用及銅綠假單胞菌的檢測方法，所述檢測銅綠假單胞菌的方法，包括以下步驟：1)提取待檢測銅綠假單胞菌樣品的基因組；2)提供所述銅綠假單胞菌的特異基因oprL擴增引物組：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；3)在包括所述擴增引物組的多交叉恒溫擴增反應體系下，使用待檢測銅綠假單胞菌樣品的基因組核酸作為模板進行恒溫擴增，得到擴增產物；4)使用金納米生物傳感器檢測步驟3)的擴增產物。本發明所述方法以多交叉恒溫擴增為基礎，結合納米生物檢測技術，能夠快捷，敏感，高特異性的鑒定銅綠假單胞菌。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，尤其涉及一種銅綠假單胞菌的擴增引物組、應用及銅綠假單胞菌的檢測方法。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又稱綠膿桿菌，屬假單胞菌屬，是一種需氧的革蘭陰性桿菌，也是一種常見的條件致病菌。該菌存在于土壤、塵埃、水和少數人體腸道中，亦可暫時寄生于皮膚，主要寄生在肛門、生殖器部位、腋窩和外耳道等處。典型的菌株產生藍綠色綠膿菌青素和黃綠色綠膿黃素兩種色素，在正常情況下銅綠假單胞菌一般不致病，當機體抵抗力低下時可致病，還可引起病人死亡。系統性銅綠假單胞菌感染可招致敗血癥，患者有發熱、黃疸、脾大，并可發生肺炎、泌尿系感染、腦膜炎。皮膚銅綠假單胞菌感染常發生在持續潮濕的損害部位，尤其在嬰兒的臍周、燒傷的表面，在浸漬的趾蹼、外耳道及耳郭亦常發生。該菌為專性需氧菌，生長溫度范圍25～42℃，最適生長溫度為25～30℃，臨床分離培養的初步鑒別可利用該菌在4℃不生長而在42℃可以生長的特點進行鑒別。研究表明假單胞菌引起的醫院感染有增多和加重的趨勢，在醫院感染標本中分離率已位居第一。其中以銅綠假單胞菌為主。目前臨床上對于銅綠假單胞菌分離鑒定主要依賴于傳統的細菌培養和生化鑒定，該方法包括二次增菌，選擇培養及后續的生化鑒定，耗時至少3天，雖然生化鑒定的結果可以依靠全自動微生物鑒定儀判讀，但該方法的劣勢耗時耗力依然存在，嚴重地拖延臨床的診斷及治療時間。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基礎的診斷技術(如普通PCR技術，熒光PCR技術)被用于銅綠假單胞菌的快速診斷，然而這些方法依賴于昂貴復雜的儀器設備及高成本的探針合成，且需要后續的電泳步驟及熟練的操作人員。一些基層實驗室無法滿足上述條件，因此限制了這些技術在基層的應用。此外，目前運用PCR方法和real-time PCR方法檢測銅綠假單胞菌的技術，檢測過程也要耗時2-4小時，也不利于快速檢測和應急檢測。因此，為了給予臨床病人準確快速的診斷，找出特異的抗菌治療方法，研發一個省時、省力和特異性較高的檢測方法，能夠快捷，敏感，特異的鑒定銅綠假單胞菌成為必要。

發明內容

針對現有技術中的上述缺陷，本發明的主要目的在于提供一種銅綠假單胞菌的擴增引物組、應用及銅綠假單胞菌的檢測方法，所述方法以多交叉恒溫擴增(MCDA)為基礎，結合納米生物檢測技術，能夠快捷，敏感，高特異性的鑒定銅綠假單胞菌。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：一種銅綠假單胞菌的擴增引物組，其特征在于：包括：如SEQ ID NO：1所示的交叉內引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉內引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置換引物F1，如SEQ ID NO：4所示的置換引物F2以及如SEQ IDNO：5-10所示的擴增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述擴增引物C1或C2的5’端標記生物素，得到C1*或C2*；所述擴增引物D1或D2的5’端標記半抗原，得到D1*或D2*。

作為進一步的優選，所述半抗原為異硫氰酸熒光素(FITC)。

作為進一步的優選，所述CP1包含C1區域的互補序列(Cls)和P1，為5′-Cls-P1；CP2包含C2區域的互補序列(C2s)和P2，為5′-C2s-P2。

所述擴增引物組用于多交叉恒溫擴增銅綠假單胞菌的oprL基因。

一種檢測銅綠假單胞菌的方法，包括以下步驟：