[發明專利]一種銅綠假單胞菌的擴增引物組、應用及銅綠假單胞菌的檢測方法

在審

• 申請號: 201810170246.1
• 申請日: 2018-03-01
• 公開（公告）號: CN108441540A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 趙帆;胡守奎;吳蕾;農金輕;高乃姝;朱曉雪;鄭鳳芝;王春梅;翟翼方;劉銘義;王靜;蔡煜;袁平
• 申請（專利權）人: 北京大學首鋼醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 馬苗苗

1.一種銅綠假單胞菌的擴增引物組，其特征在于：包括：如SEQ ID NO：1所示的交叉內引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉內引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置換引物F1，如SEQID NO：4所示的置換引物F2以及如SEQ ID NO：5-10所示的擴增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述擴增引物C1或C2的5’端標記生物素，得到C1*或C2*；所述擴增引物D1或D2的5’端標記半抗原，得到D1*或D2*。

2.根據權利要求1所述的銅綠假單胞菌的擴增引物組，其特征在于：所述半抗原為異硫氰酸熒光素。

3.根據權利要求1所述的銅綠假單胞菌的擴增引物組，其特征在于：所述交叉內引物CP1包含C1區域的互補序列Cls和P1，為5′-Cls-P1；所述交叉內引物CP2包含C2區域的互補序列C2s和P2，為5′-C2s-P2。

4.如權利要求1-3任一項所述銅綠假單胞菌的擴增引物組的應用，其特征在于：所述擴增引物組用于多交叉恒溫擴增銅綠假單胞菌的oprL基因。

5.一種檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)提取待檢測銅綠假單胞菌樣品的基因組；

2)提供所述銅綠假單胞菌的擴增引物組：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；

3)在包括所述擴增引物組的多交叉恒溫擴增反應體系下，使用待檢測銅綠假單胞菌樣品的基因組核酸作為模板進行恒溫擴增，得到擴增產物；

4)使用金納米生物傳感器檢測步驟3)的擴增產物。

6.根據權利要求5所述檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：所述步驟3)恒溫擴增是在60-69℃下進行。

7.根據權利要求5所述檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：所述引物C1和CP1的濃度為30pmol，引物CP2的濃度為60pmol，引物F1和F2的濃度為10pmol，引物R1，R2，D1*和D2的濃度為30pmol，引物C1*和C2的濃度為20pmol。

8.根據權利要求5所述檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：所述多交叉恒溫擴增反應體系還包括10mM的Betain，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶緩沖液，10U的鏈置換DNA聚合酶，1μL的模板，補加去離子水至25μl。

9.根據權利要求8所述檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：所述多交叉恒溫擴增反應體系的反應恒溫在67℃下40min，85℃下5min終止反應。

10.根據權利要求5所述檢測銅綠假單胞菌的方法，其特征在于：所述金納米生物傳感器包含樣品墊，金標墊，纖維膜，吸水墊及背板；所述樣品墊，金標墊，纖維膜及吸水墊依次組裝在背板上，所述纖維膜上設置有檢測線及控制線；將金納米粒子偶聯的鏈霉素親和素，抗異硫氰酸熒光素抗體及生物素偶聯的牛血清蛋白分別包被在金標墊，檢測線及控制線上。