[發明專利]一種KRAS基因突變檢測的引物探針組合及其應用

在審

• 申請號: 201810166548.1
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN108220444A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 盛青松;白靜;姚魯帥
• 申請（專利權）人: 無錫禾盛醫療器械有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明涉及一種基因突變的檢測產品，具體涉及一種KRAS基因突變檢測的引物探針組合及其應用，所述引物探針組合包括檢測引物探針，所述檢測引物探針包括KRAS基因突變檢測特異性引物對、KRAS基因特異性探針、擴增阻斷探針和內參系統；其中，所述KRAS基因的突變檢測的位點為外顯子1的12和13密碼子，具體為G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V和G13D突變位點。本發明對KRAS基因突變具有特異性強、靈敏度高、操作簡單快速等優點，檢測結果具有較好的準確性和重復性，可以對腫瘤組織樣本進行檢測，能夠輔助臨床治療，具有重要價值。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種基因突變的檢測產品，具體涉及一種KRAS基因突變檢測的引物探針組合及其應用。

背景技術

肺癌、結直腸癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，并已成為絕大多數國家癌癥死亡的主要原因。其中肺癌以非小細胞肺癌(NSCLC)最常見。KRAS基因位于染色體12p12.1，是重要的癌基因之一，編碼一種21kD的KRAS蛋白，參與細胞內的信號傳遞，主要包括RAS/P13K/PTEN/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK 信號轉導途徑，這些轉導途徑是當前腫瘤靶向藥物研究的熱點，靶向藥物通過抑制這些途徑發生藥理作用。研究表明，非小細胞肺癌、結直腸癌組織存在 KRAS基因突變，KRAS基因第12和13密碼子發生突變，將導致KRAS蛋白變異并處于持續激活狀態，使藥物失效。

KRAS基因突變可導致EGFR信號通路下游持續激活，是TKI原發耐藥機制之一。大量臨床研究表明，靶向藥物對于未發生KRAS基因突變的患者有效率可達到60％，而對已發生KRAS基因突變的患者則完全無效。但是，2010年 10月最新研究發現第13密碼子上的G13D突變亦對抗體類藥物有治療反應性。通過檢測K-ras基因有沒有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現腫瘤病人的個體化治療，從而延長患者生存期。對于沒有突變的患者，則能減少不必要的治療費用和毒副作用。KRAS 基因突變對癌癥的發生、形成過程起重要作用。最常見的突變位點90％-97％發生在在外顯子1的12和13密碼子，其中70％發生于第12密碼子，30％發生于13密碼子。

對K-ras突變的檢測方法有直接測序法、突變體富集PCR、ARMS-PCR、高分辨率熔解曲線(HRM)以及TaqMan-MGB法等，直接測序敏感性低，費用高；突變富集體PCR容易造成PCR的污染而導致假陽性；HRM對模板的要求高，敏感度不高；TaqMan-PCR在敏感度和準確性上均有所提高，但是 ARMS-MGB法要比TaqMan-PCR敏感度、準確性還高，且特異性很高。

ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，突變擴增阻滯系統)技術，是一種利用序列特異性引物對模板進行選擇性擴增而達到檢測基因突變的方法。ARMS技術利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，針對不同的已知突變，設計適當的引物以檢測出突變基因(即利用特異引物對突變靶序列進行高精準的PCR擴增放大)；同時利用探針對擴增產物進行檢測，在實時熒光定量PCR平臺上實現對樣品DNA中稀有突變的檢測。

市場上已有采用ARMS-PCR的檢測試劑，CN 105567854 A公開了一種檢測人EGFR、KRAS、KRAS基因突變的ARMS引物，其在ARMS實時熒光定量技術中引入了雙內參系統，還增加了和突變位點一致的正常位點參照，使其成為雙內參系統和雙重判讀規則的試劑盒。CN102367478 A公開了一種用于 KRAS基因突變分型的ARMS-qPCR檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包括 qPCR混合反應液、鎖核酸阻滯探針、參照引物、ARMS引物和陽性對照樣品。但現有的方法ARMS-PCR的檢測試劑檢測精準度和特異性不夠高，難以在大范圍內普及使用。