[發(fā)明專利]一種KRAS基因突變檢測(cè)的引物探針組合及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810166548.1
• 申請(qǐng)日: 2018-02-28
• 公開（公告）號(hào): CN108220444A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛青松;白靜;姚魯帥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫禾盛醫(yī)療器械有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種KRAS基因突變檢測(cè)的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括檢測(cè)引物探針，所述檢測(cè)引物探針包括對(duì)KRAS基因突變檢測(cè)特異性引物對(duì)、KRAS基因特異性探針、擴(kuò)增阻斷探針和內(nèi)參系統(tǒng)；

其中，所述KRAS基因的突變檢測(cè)的位點(diǎn)為外顯子1的12和13密碼子，具體為G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V和G13D突變位點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述KRAS基因突變檢測(cè)特異性引物對(duì)的錯(cuò)配率為15-30％，優(yōu)選為20-25％；

優(yōu)選地，所述擴(kuò)增阻斷探針與KRAS基因突變檢測(cè)特異性引物對(duì)中的下游引物的堿基重疊序列為3-10bp，優(yōu)選為6-9bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物探針組合，其特征在于，所述擴(kuò)增阻斷探針的3’端磷酸化；

優(yōu)選地，所述KRAS基因特異性探針和所述擴(kuò)增阻斷探針的5’端帶有熒光基團(tuán)；

優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為FAM和/或NED；

優(yōu)選地，所述KRAS基因特異性探針和所述擴(kuò)增阻斷探針的3’端帶有淬滅集團(tuán)；

優(yōu)選地，所述淬滅基團(tuán)選自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為MGB。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物探針組合，其特征在于，所述KRAS基因突變檢測(cè)特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9所示；

優(yōu)選地，所述KRAS基因特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.10-11所示；

優(yōu)選地，所述擴(kuò)增阻斷探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.12-14所示；

優(yōu)選地，所述內(nèi)參系統(tǒng)包括內(nèi)參引物對(duì)和內(nèi)參探針；

優(yōu)選地，所述內(nèi)參引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；

優(yōu)選地，所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

5.一種檢測(cè)KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的引物探針組合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控和輔助試劑；

優(yōu)選地，所述陰性質(zhì)控為TE緩沖液；

優(yōu)選地，所述陽(yáng)性質(zhì)控為KRAS基因G12A突變質(zhì)粒，所述突變質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQID NO.18所示；

優(yōu)選地，所述輔助試劑為Taq酶、dNTPs、MgCl₂和PCR反應(yīng)緩沖液。

7.一種利用如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒用于檢測(cè)KRAS基因突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣本DNA；

(2)向步驟(1)樣本DNA中加入PCR緩沖液、Taq酶、dNTPs、MgCl₂、KRAS基因突變檢測(cè)特異性引物對(duì)、KRAS基因特異性探針、擴(kuò)增阻斷探針、內(nèi)參引物對(duì)、內(nèi)參探針、陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控；

(3)PCR擴(kuò)增。