[發明專利]一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法在審
| 申請號： | 201810164904.6 | 申請日： | 2018-02-28 |
| 公開（公告）號： | CN108546680A | 公開（公告）日： | 2018-09-18 |
| 發明（設計）人： | 黃繼紅;張相生;惠明;廖愛美;侯銀臣;馮軍偉 | 申請（專利權）人： | 河南科譜特醫藥科技研究院有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/09 | 分類號： | C12N5/09;G01N33/68 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 471000 河南省洛陽市中國（河南）自由貿*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 清蛋白 麥胚 誘導肝癌細胞 分泌 技術路線圖 標志蛋白 肝癌細胞 納米顆粒 數量分布 上清液 試劑盒 抗體 粒徑 細胞 跟蹤 檢測 分析 | ||
1.一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，其特征在于：包括以下步驟：
步驟1：使用無外泌體的胎牛血清培養HepG2 細胞，待細胞長到50%～65%時，向其中加入WGA（終濃度0.1 mM～0.5 mM）繼續培養24小時；對照組不加WGA；
步驟2：24小時后，收集上清液于15 ml無菌離心管中進行離心處理（3000 g，15分鐘）；離心結束后小心將上清移至另一15 ml無菌離心管中，同時根據說明書加入相應量的ExoQuick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后輕輕上下顛倒充分混勻；放入4 ℃冰箱中，靜置過夜，時間至少控制在12小時以上；
步驟3：將步驟2的混合液進行離心（1500 g，30分鐘），小心倒掉上清，注意不能沖掉底部沉淀；再次離心（1500 g，5分鐘）；用移液槍盡量吸去上清，所得的最終沉淀即為外泌體；加入160 μl PBS重懸外泌體，并充分混勻；分裝后，-80 ℃保存備用；
步驟4：納米顆粒跟蹤分析技術是一種比較新穎的表征納米顆粒的方法，它可直接并實時觀測納米顆粒；NTA 通過光學顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學濃度；
步驟5：Western blot 方法檢測外泌體的標志物，從-80 ℃冰箱中取出外泌體，冰上自然解凍；加入相應量的蛋白裂解液（RIPA+ 1 mM PMSF），冰上裂解10 分鐘；提取蛋白后，使用 Western blot 方法檢測外泌體標志蛋白CD63的表達。
2.根據權利要求1所述的麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，其特征在于：步驟1培養HepG2細胞時，細胞長到50%～65%時，向其中加入麥胚清蛋白（WGA終濃度0.1 mM～0.5 mM）。
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