[發明專利]一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法

在審

• 申請號: 201810164904.6
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN108546680A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 黃繼紅;張相生;惠明;廖愛美;侯銀臣;馮軍偉
• 申請（專利權）人: 河南科譜特醫藥科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1：使用無外泌體的胎牛血清培養HepG2 細胞，待細胞長到50%～65%時，向其中加入WGA（終濃度0.1 mM～0.5 mM）繼續培養24小時；對照組不加WGA；

步驟2：24小時后，收集上清液于15 ml無菌離心管中進行離心處理（3000 g，15分鐘）；離心結束后小心將上清移至另一15 ml無菌離心管中，同時根據說明書加入相應量的ExoQuick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后輕輕上下顛倒充分混勻；放入4 ℃冰箱中，靜置過夜，時間至少控制在12小時以上；

步驟3：將步驟2的混合液進行離心（1500 g，30分鐘），小心倒掉上清，注意不能沖掉底部沉淀；再次離心（1500 g，5分鐘）；用移液槍盡量吸去上清，所得的最終沉淀即為外泌體；加入160 μl PBS重懸外泌體，并充分混勻；分裝后，-80 ℃保存備用；

步驟4：納米顆粒跟蹤分析技術是一種比較新穎的表征納米顆粒的方法，它可直接并實時觀測納米顆粒；NTA 通過光學顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學濃度；

步驟5：Western blot 方法檢測外泌體的標志物，從-80 ℃冰箱中取出外泌體，冰上自然解凍；加入相應量的蛋白裂解液（RIPA+ 1 mM PMSF），冰上裂解10 分鐘；提取蛋白后，使用 Western blot 方法檢測外泌體標志蛋白CD63的表達。

2.根據權利要求1所述的麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，其特征在于：步驟1培養HepG2細胞時，細胞長到50%～65%時，向其中加入麥胚清蛋白（WGA終濃度0.1 mM～0.5 mM）。