[發(fā)明專利]一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810164904.6
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN108546680A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發(fā)明（設計）人: 黃繼紅;張相生;惠明;廖愛美;侯銀臣;馮軍偉
• 申請（專利權）人: 河南科譜特醫(yī)藥科技研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法。使用一定濃度的麥胚清蛋白（WGA）與肝癌細胞共培養(yǎng)24小時，分別收集WGA組（Exo?WGA）和對照組細胞（Exo?con）的上清液，使用Exo Quick?TC試劑盒提取外泌體（exosome）；Western?Blot方法檢測鑒定exosomes標志蛋白CD63（抗體）的表達。通過納米顆粒跟蹤分析技術（NTA）確定exosome的粒徑數(shù)量分布。技術路線圖見附圖1。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法。

背景技術

外泌體無論在正常細胞還是異常細胞中都能分泌。由于外泌體是囊泡結構，又有母細胞分泌而來。因此有兩點信息非常重要，一個是攜帶了母細胞的信息，一個是保護了內(nèi)部成分在細胞外免受降解。研究表明，外泌體無論對于正常生命過程或者是疾病發(fā)生發(fā)展都有著重要的作用。外泌體的大小：外泌體的直徑約40-150 nm；隨著對外泌體研究的深入，已經(jīng)證明，不同細胞來源的外泌體能有效激活或抑制免疫應答、促進炎癥反應、參與自體免疫性疾病和感染性疾病的調(diào)控作用。用各種天然和化學化合物處理親本細胞可以調(diào)節(jié)miRNA選擇性的分選成外泌體的過程。

胚芽具有應激相關蛋白（脅迫/疾病/防御）21.6%，信號傳導蛋白（SignalTransduction）占10.4%，能明顯提高小鼠的脾指數(shù)、腹腔巨噬細胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)和B淋巴細胞的轉化功能。麥胚鹽提物中分離出了α、γ型蛋白，其中γ型蛋白與免疫球蛋白結構類似。麥胚清蛋白較強的免疫刺激和抑制癌轉移效應，可成功地用作免疫刺激和轉移抑制藥用組合物中的活性物質(zhì)，尤其是對肝癌細胞的轉移有明顯地抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，采用富含營養(yǎng)因子的麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌大量外泌體，提高外泌體的分泌量。

一種一種麥胚清蛋白誘導肝癌細胞分泌外泌體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1：使用無外泌體的胎牛血清培養(yǎng)HepG2 細胞，待細胞長到50%～65%時，向其中加入WGA（終濃度0.1 mM～0.5 mM）繼續(xù)培養(yǎng)24小時；對照組不加WGA。

步驟2：24小時后，收集上清液于15 ml無菌離心管中進行離心處理（3000 g，15分鐘）；離心結束后小心將上清移至另一15 ml無菌離心管中，同時根據(jù)說明書加入相應量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后輕輕上下顛倒充分混勻；放入4℃冰箱中，靜置過夜，時間至少控制在12小時以上。

步驟3：將步驟2的混合液進行離心（1500 g，30分鐘），小心倒掉上清，注意不能沖掉底部沉淀；再次離心（1500 g，5分鐘）；用移液槍盡量吸去上清，所得的最終沉淀即為外泌體；加入160 μl PBS重懸外泌體，并充分混勻；分裝后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟4：納米顆粒跟蹤分析技術是一種比較新穎的表征納米顆粒的方法，它可直接并實時觀測納米顆粒。NTA 通過光學顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像，對每個顆粒的布朗運動進行追蹤和分析，從而計算出納米顆粒的流體力學濃度。

步驟5：Western blot方法檢測外泌體的標志物，從-80 ℃冰箱中取出外泌體，冰上自然解凍，加入相應量的蛋白裂解液（RIPA+ 1 mM PMSF），冰上裂解10分鐘。提取蛋白后，使用Western blot方法檢測外泌體標志蛋白CD63的表達。

附圖說明

圖1是技術路線圖；

圖2是實施例1的WGA誘導組和對照組標志蛋白CD63表達；

圖3是實施例2的WGA誘導組和對照組標志蛋白CD63表達；