[發明專利]一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法

有效

• 申請號: 201810164427.3
• 申請日: 2018-02-27
• 公開（公告）號: CN108088986B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 謝兆文;譚禮寧;呂小婷;葉盛聰;邱靈珊;陳盛勇;劉楚楚;徐磊;劉友霖
• 申請（專利權）人: 派生特（福州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/071;G01N33/50
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

1.一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：其包括以下步驟：

1）取偽狂犬病活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基稀釋至含200TCID₅₀的病毒液；

取豬脾轉移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基稀釋，將多肽含量稀釋至1 mg/mL；

2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基中將pk-15細胞培養至單層；

3) 取步驟2)中的單層細胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基稀釋，調整細胞濃度為2~3×10⁵個/mL，將稀釋后的細胞接種于細胞培養板中，繼續培養；形成細胞單層后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞板，去除培養基；

4）將步驟1）稀釋后的病毒液以及稀釋后的豬脾轉移因子上樣于步驟3）的細胞培養板中，并培養孵育細胞；上樣量為100 μL/孔，具體如下：

含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基40-50μL ；

病毒液15-25μL；

豬脾轉移因子30-40 μL；

5) 將步驟4）孵育的細胞用MTT溶液進行反應，繼續孵育；

6) 將步驟5）孵育的細胞用二甲基亞砜進行溶解處理；

7）將步驟6）處理后的細胞板放置于酶標儀中測量OD值，測定細胞活性。

2.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟1）中，所述偽狂犬病活疫苗為Bartha-K61株。

3.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟3）中，所述細胞培養板為96孔細胞培養板。

4.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟3）中，細胞稀釋的具體步驟如下：將步驟2)中的單層細胞用磷酸鹽緩沖液洗2-3次，然后加入胰酶消化液使其布滿所有細胞表面，于37℃放置數分鐘，然后棄去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基將細胞洗脫，將洗脫后的細胞懸液進行稀釋，調整細胞濃度為2~3×10⁵個/mL。

5.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟3）中，稀釋后的細胞培養條件為：細胞接種量100 μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO₂條件下培養18-24 h形成細胞單層。

6.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟4）中，上樣量具體如下：

含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-鏈霉素雙抗的完全DMEM培養基45μL ；

病毒液20μL；

豬脾轉移因子35 μL。

7.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟4）中，培養孵育細胞的條件為在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO₂條件下培養40-48 h 。

8.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟5）中，細胞繼續孵育的時間為3.5-4.5h。

9.根據權利要求1所述的一種檢測豬脾轉移因子與偽狂犬病活疫苗聯合免疫效果的方法，其特征在于：步驟7）中，于480-500nm波長處測量OD值。