[發(fā)明專利]家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19及其表達載體和應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810162527.2
• 申請日: 2018-02-27
• 公開（公告）號: CN108148839A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 姚倫廣;劉陽坤;李娜;胡小敏;王鐵軍;程天才;尹延震
• 申請（專利權(quán)）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/866;C12N15/66;C12N15/11;C12N9/02
• 代理公司: 北京中恒高博知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11249
• 代理人: 陸菊華

本發(fā)明公開了家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19，啟動子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；并提供了其表達載體pFBDM?LP19?Fluc?IG和應用；表達載體通過轉(zhuǎn)座的方式，利用asd缺失型rSW106?inv菌感染Sf9細胞和BmN細胞獲得重組桿狀病毒，將重組病毒分別重新感染Sf9細胞和家蠶幼蟲后，通過熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶的活性。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19及其表達載體和應用，證實了啟動子LP19可在Sf9昆蟲細胞和家蠶幼蟲中驅(qū)動外源基因進行表達，豐富了昆蟲—桿狀病毒表達系統(tǒng)中基因啟動子的選擇，為LP19啟動子在桿狀病毒表達外源蛋白中的應用提供依據(jù)；表明LP19啟動子在桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組藥物、疫苗等方面，具有良好的應用潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19及其表達載體和應用。

背景技術(shù)

昆蟲基因啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的能與RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的一段特定DNA序列。該序列在昆蟲基因的表達調(diào)控中起著關(guān)鍵作用：決定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率。此外，昆蟲基因啟動子在構(gòu)建外源基因的表達載體的過程中具有重要作用，它決定了外源基因表達的時空順序、表達強度、轉(zhuǎn)錄效率和基因的表達水平。所以，研究昆蟲啟動子的功能對于基因的表達調(diào)控機制和昆蟲基因工程技術(shù)的發(fā)展具有十分重要的科學意義。

研究表明昆蟲基因啟動子存在多種特征元件，通過與RNA聚合酶識別、結(jié)合，從而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄過程。昆蟲基因啟動子具備真核生物啟動子的典型特征，一般具有以下結(jié)構(gòu)：(1)轉(zhuǎn)錄起始位點：通常位于翻譯起始密碼子(AUG)上游-40～-70bp處。大多數(shù)情況下(＞90％)轉(zhuǎn)錄起始位點周圍為嘌呤殘基；(2)TATA box：一般位于-25～-35bp處，其一致性序列為TATAWAW(W代表A或T)。TATA box并不是一成不變的，其中在真核生物中有43％的結(jié)構(gòu)基因啟動子中有TATA box；(3)CAGT box：通常位于TATA box上游-10～-40bp處，對它的缺失或突變會影響啟動子活性。除此之外，有的昆蟲基因啟動子還具有GC box、CAAT box等基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和其它的一些組織特異型調(diào)控元件。

當前，隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展和昆蟲基因組研究的日益成熟，利用昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)進行藥物研發(fā)、疫苗生產(chǎn)、基因治療、重組桿狀病毒殺蟲劑等方面的研究得到了廣泛的關(guān)注。桿狀病毒表達系統(tǒng)使用較多的啟動子是多角體(polh)啟動子和p10啟動子，目前已經(jīng)成功表達了上千種外源蛋白，但是如何提高外源蛋白表達量和組織表達特異性仍然制約著昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)的大規(guī)模推廣應用。為了更好的利用昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白，國內(nèi)外許多學者采取優(yōu)化啟動子的方法對桿狀病毒進行改造。因此，發(fā)掘昆蟲中新的啟動子，并對其啟動子活性進行研究，對昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟價值和應用價值。

家蠶是鱗翅目的模式昆蟲，其血液中有有一些含量豐富的蛋白質(zhì)。其中，30K蛋白因其分子質(zhì)量而得名，是家蠶末齡后期至蛹期血液中含量最高的一類蛋白質(zhì)。其中，載脂蛋白19G1被認為是屬于的與結(jié)構(gòu)相關(guān)“30K蛋白”，是五齡幼蟲及蛹中主要的蛋白組分，大量分布在血淋巴和卵細胞中。因此，位于家蠶30K蛋白19G1基因上游的啟動子作為重要的表達調(diào)控元件，克隆其啟動子核苷酸序列，研究其在外源蛋白表達載體中的活性，可以為昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)提供重要的啟動子序列資源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19及其表達載體和應用，以豐富昆蟲--桿狀病毒表達系統(tǒng)中基因啟動子的選擇。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：家蠶30K蛋白19G1基因啟動子LP19，所述的啟動子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供了含有上述的啟動子LP19的重組桿狀病毒表達載體pFBDM-LP19-Fluc-IG。