[發(fā)明專利]一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法及其試劑盒和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810161602.3
• 申請(qǐng)日: 2018-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN108330181A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮宇亮;姜昊;陳海洋;鄭曉斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州睿邁英基因檢測(cè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6804
• 分類號(hào): C12Q1/6804;C12Q1/6869
• 代理公司: 蘇州國(guó)誠(chéng)專利代理有限公司 32293
• 代理人: 李鳳嬌

本發(fā)明公開了一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法，包括以下步驟：步驟一：染色質(zhì)預(yù)清除；步驟二：對(duì)預(yù)清除后的染色質(zhì)進(jìn)行免疫共沉淀，然后加入轉(zhuǎn)座體系進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)；步驟三：用AMPure beads對(duì)已轉(zhuǎn)座的DNA進(jìn)行純化；步驟四：文庫擴(kuò)增；步驟五：文庫大小選擇；其中，步驟二中還包括標(biāo)簽片段化方法。本發(fā)明的目的是提出一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法及其試劑盒和應(yīng)用，通過對(duì)ChIP?seq方法的改進(jìn)，能有效對(duì)少細(xì)胞進(jìn)行組蛋白修飾進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與大量細(xì)胞的檢測(cè)的結(jié)果完全一致。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法及其試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)

組蛋白是染色體基本結(jié)構(gòu)--核小體中的重要組成部分，其多種氨基酸殘基可發(fā)生乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitylation)等多種共價(jià)修飾作用。最新的研究表明，組蛋白氨基酸殘基上還可以發(fā)生如巴豆酰化(crotonylation)、丙酰化(propionylation)、丁酰化(butyrylation)、2-羥基異丁基酰化(2-ohi-butyrylation)、琥珀酰化(succinylation)等全新的修飾類型，從而大大拓展了對(duì)組蛋白修飾的認(rèn)識(shí)。組蛋白修飾可通過影響組蛋白與DNA雙鏈的親和性，從而改變?nèi)旧|(zhì)的疏松或凝集狀態(tài)，或通過影響其它轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的親和性來發(fā)揮基因調(diào)控作用。組蛋白修飾對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控有類似DNA遺傳密碼的調(diào)控作用，是表觀遺傳學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。因此，組蛋白修飾又稱為“組蛋白密碼”或“表觀遺傳學(xué)密碼”。

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(chromatin-immunoprecipitation，ChIP)，因其能真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的靶蛋白的調(diào)控信息，是目前基于全基因組水平研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。基本原理與過程：通過在特定時(shí)間點(diǎn)上用甲醛交聯(lián)等方式“固定”細(xì)胞內(nèi)所有DNA結(jié)合蛋白的活動(dòng)，相當(dāng)于這一時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞內(nèi)蛋白和DNA相互作用的關(guān)系被瞬時(shí)“快照(snapshot)”下來。再通過后續(xù)的裂解細(xì)胞、斷裂DNA，將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物與特定DNA結(jié)合蛋白的抗體孵育，然后將與抗體特異結(jié)合的蛋白-DNA復(fù)合物洗脫下來，最后將洗脫得到的特異DNA與蛋白解離、純化DNA后，進(jìn)行建庫測(cè)序。然而，常規(guī)的ChIP-seq方法需要大量的細(xì)胞(107細(xì)胞以上)，無法滿足腫瘤干細(xì)胞等。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法及其試劑盒和應(yīng)用，克服了現(xiàn)有染色質(zhì)免疫共沉淀需要大量細(xì)胞的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

一種適用于少細(xì)胞的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序方法，包括以下步驟：

步驟一：染色質(zhì)預(yù)清除，以減少背景信號(hào)；

步驟二：對(duì)預(yù)清除后的染色質(zhì)進(jìn)行免疫共沉淀，然后加入轉(zhuǎn)座體系進(jìn)行轉(zhuǎn)座反應(yīng)；

步驟三：用AMPure beads對(duì)已轉(zhuǎn)座的DNA進(jìn)行純化，經(jīng)典的ChIP通過商品化柱子(如Qiagen MinElute kit)對(duì)IP的DNA進(jìn)行過柱純化，使DNA損失較多，會(huì)造成文庫復(fù)雜度降低，而AMPure beads回收可減少DNA的損失(約30％)；

步驟四：文庫擴(kuò)增；

步驟五：文庫大小選擇；

其中，步驟二中還包括標(biāo)簽片段化方法，減少了建庫過程的步驟，從而減少了材料的損耗。

進(jìn)一步的，所述標(biāo)簽片段化方法具體為在PCR儀中37℃孵育20分鐘。