[發(fā)明專利]一種具有生物活性的COX18多肽及其合成方法與用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810160921.2
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN108315308A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李臣鴻;雷維瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中南民族大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;A61K38/44;A61P5/50;A61P3/04
• 代理公司: 武漢華旭知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 42214
• 代理人: 劉天鈺

1.一種具有生物活性的COX18多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：LLPAGWILSH LETYRRPE。

2.權(quán)利要求1所述COX18多肽的固相合成方法，其特征在于所述固相合成方法包括以下步驟：

(1)、縮合反應(yīng)：使用DMF預(yù)溶脹樹脂，濾去溶劑備用；向反應(yīng)柱中加入脫保護(hù)試劑，反應(yīng)后脫去樹脂上的的FMoc保護(hù)基團(tuán)，抽干，繼續(xù)采用DMF清洗后抽干，并檢測；

稱取第一個(gè)Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同時(shí)稱取HOBt備用，將二者同時(shí)加入反應(yīng)柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并攪拌；稱取DMAP投入反應(yīng)柱中；氨基酸與反應(yīng)試劑一同反應(yīng)，反應(yīng)完畢后抽干并用DMF清洗；向反應(yīng)柱中加入脫保護(hù)試劑，反應(yīng)后，脫去樹脂上的的FMoc保護(hù)基團(tuán)，抽干，繼續(xù)采用DMF清洗后抽干，并檢測；

接下來的按照COX18多肽的順序重復(fù)添加肽鏈上的下一氨基酸，直至整條肽鏈18個(gè)氨基酸全部添加完成并檢測通過；全部完成后，使用無水甲醇清洗并使用抽濾瓶將其抽干；

(2)、肽鏈的切割：在抽干的合成肽樹脂中加入切割液，在通風(fēng)櫥中室溫?cái)嚢枇呀猓褂蒙靶韭┒愤^濾除去樹脂，收集濾液，濾液經(jīng)乙醚萃取后放置于干燥瓶內(nèi)進(jìn)行干燥，直至其成為白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的檢測和純化：利用高效液相色譜檢測合成的多肽粗品，并分析合成產(chǎn)物中多肽的純度；

(4)、肽的質(zhì)譜鑒定：用質(zhì)譜檢測多肽粗品的分子量，確定合成的多肽是否是目標(biāo)產(chǎn)物，最后將收集的樣品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入樣品杯中，冷凍過夜，次日用真空干燥劑冷凍干燥，最后獲得的白色粉末狀物質(zhì)即為純品COX18多肽。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步驟(1)中所述脫保護(hù)及縮合反應(yīng)的檢測方法如下：檢測時(shí)分別取三滴5％茚三酮無水乙醇溶液和三滴80％苯酚無水乙醇溶液與待檢測樹脂顆粒充分混勻，105℃加熱5m in，觀察顏色變化，若變藍(lán)色或紫色，則說明游離氨基存在，脫保護(hù)完全；若為亮黃色或無色則表示縮合完全，能夠繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)縮合反應(yīng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步驟(1)中在合成每一個(gè)氨基酸時(shí)，反應(yīng)過程中維持溫度在25℃～28℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步驟(2)中萃取的步驟為：在濾液中按1：10的體積比加入事先4℃下預(yù)冷的乙醚，進(jìn)行萃取，再以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心2分鐘，并使用乙醚清洗離心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分鐘離心。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步驟(3)中高效液相色譜檢測的方法為：取多肽粗品置于EP管，加入三氟乙酸和水，于超聲振蕩機(jī)中震蕩使多肽粗品溶解，用C18分析柱進(jìn)行HPLC，流動(dòng)相：A相：乙腈，0.1％TFA；B相：水，0.1％TFA，洗脫梯度：B相的濃度從90％到0，洗脫速度1mL/min，洗脫時(shí)間25min，檢測波長220nm。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步驟(4)中質(zhì)譜分析采用ESI正離子模式，離子電壓為8000v，碰撞氣體為N2，脫溶劑氣溫度350e，注射泵進(jìn)樣速度為10uL/min。

8.權(quán)利要求1所述的COX18多肽的用途，其特征在于：用于制備抑制糖誘導(dǎo)的胰島素的分泌、抵抗胰島素耐受、抵抗高胰島素血癥和減輕體重的藥物中。