[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法

在審

• 申請號: 201810160883.0
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108309822A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 肖桂清;蘇愛盟;陳光煜;張倩倩
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司
• 主分類號: A61K8/64
• 分類號: A61K8/64;A61K38/20;A61K38/19;A61K38/18;A61K9/19;A61K47/42;A61Q19/00;A61Q19/08;C12N5/0775;A61P39/06;A61P17/16
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，包括臍帶間充質干細胞分離制備和鑒定、臍帶間充質干細胞上清液獲取、間充質干細胞因子的分離純化、間充質干細胞因子凍干粉制備。本發明采用了無血清培養體系培養人臍帶間充質干細胞，避免了FBS中動物源成分對皮膚的刺激。此外，本發明采用單一樣本來源，ELISA法測定蛋白濃度準確，保證批次產品均一性。使用細胞工廠作為培養載體，模擬體內低氧環境，刺激細胞大量分泌細胞因子，提高產量。再者，采用低溫凍干技術，使產品可在常溫下保存，方便運輸，且有限延長干細胞旁分泌因子活性保存期限。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法。

背景技術

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞。MSC具有免疫調控、促進造血干細胞歸巢、能夠修復損傷或病變的組織器官、具備多向分化潛能等功能，因此具有廣泛的應用前景。

隨著對間充質干細胞研究的不斷深入，其作用機理也越來越清晰明確，主要有3方面：1、間充質干細胞旁分泌作用。2、間充質干細胞替代或修復死亡或受損的組織細胞。3、細胞直接接觸，調控細胞。越來越多的研究表明，間充質干細胞旁分泌作用在其發揮治療效果中起主要作用。臍帶間充質干細胞在培養過程中可分泌多種細胞因子，如表皮生長因子(EGF) ，血管內皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、肝細胞生長因子(HGF)，基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、腫瘤壞死因子(TNF)，神經生長因子(NGF)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、白介素6（IL-6）等。間充質干細胞所分泌的因子具有改善細胞生長微環境、調節機體免疫、促進血管再生、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等功能，對受損皮膚、敏感皮膚以及改建性皮膚具有良好的修復、護理作用，能促進膠原蛋白合成，延緩衰老等。

將細胞旁分泌因子提純濃縮后添加到美容化妝品中，是化妝品行業發展的新趨勢。含細胞旁分泌因子的化妝品現已在多個國家上市，尤其是在韓國和日本，細胞旁分泌因子化妝品尤為甚行。但市面上的細胞旁分泌因子化妝品一般采用干細胞培養上清液直接摻入化妝品基質的方式生產，細胞旁分泌因子含量低，均一性差，穩定性差，美容護膚抗衰效果一般。

目前技術缺陷：現有技術是用普通培養瓶培養間充質干細胞，并收集合并多代細胞培養上清液，并對上清液進行過濾得到細胞旁分泌因子。該方法得到的間充質干細胞旁分泌因子含量低，且該方法需要收集多代細胞培養基，效率低，且多代收集的方法制備細胞旁分泌因子，產品均一性較難保證。此外，該方法制備所得細胞旁分泌因子為液態，常溫下易降解，需低溫保存，加大保存和運輸難度。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術的上述缺陷，提供一種細胞旁分泌因子產量高、均一性好、穩定性好，易保存和運輸的人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種細胞旁分泌因子產量高、均一性好、穩定性高的人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，包括以下步驟：

1、臍帶間充質干細胞分離制備和鑒定

（1）取健康足月的新生兒臍帶靠近嬰兒端20cm，置于含儲運液的儲運瓶中，待分離制備；