[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法

在審

• 申請號: 201810160883.0
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108309822A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 肖桂清;蘇愛盟;陳光煜;張倩倩
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司
• 主分類號: A61K8/64
• 分類號: A61K8/64;A61K38/20;A61K38/19;A61K38/18;A61K9/19;A61K47/42;A61Q19/00;A61Q19/08;C12N5/0775;A61P39/06;A61P17/16
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：包括臍帶間充質干細胞分離制備和鑒定、臍帶間充質干細胞上清液獲取、間充質干細胞因子的分離純化、間充質干細胞因子凍干粉制備。

2.根據權利要求1所述的一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：所述的臍帶間充質干細胞分離制備和鑒定方法為：

（1）取健康足月的新生兒臍帶靠近嬰兒端20cm，置于含儲運液的儲運瓶中，待分離制備；

（2）將臍帶置于培養皿中，用生理鹽水充分洗滌臍帶，將臍帶兩端各剪去1cm長度，丟棄；再反復洗滌臍帶組織，直至無明顯血塊；將臍帶剪成2cm長度的小段，清洗3次；將臍帶縱向剖開，剔除血管，撕取華通膠；用生理鹽水充分洗滌華通膠3次，后將其剪碎成1mm³～3mm³大小組織塊；將組織塊接種于培養瓶中，放置于37℃，5％的CO₂的培養箱中貼壁2h，添加15ml無血清完全培養基，置于培養箱中培養，培養最初7d，保持培養瓶絕對靜止；8d在顯微鏡下觀察，可見組織塊周圍有成纖維狀細胞爬出；12d細胞數量較多，去除組織塊，用胰蛋白酶消化將貼壁細胞轉移至新的T175培養瓶中培養后進行傳代。

3.根據權利要求2所述的一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：其中儲運液為40ml的α-MEM，并添加了慶大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，兩性霉素B 5ug/ml；無血清完全培養基為：體積濃度為2%血清替代物和體積濃度為1% GlutaMAX?-I，其余為LONZA無血清培養基。

4.根據權利要求1所述的一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：所述臍帶間充質干細胞上清液獲取：將檢測合格的細胞按3~5×10⁴/ml的終濃度轉至細胞工廠，做好標記，置37℃、5% CO₂的培養箱中進行擴增培養；當擴增培養的細胞長至細胞融合度70%-80%時，調整參數為37℃、5% CO_2、5% O₂繼續培養，24h后調整參數為37℃、5% CO_2、15% O₂，48h后收集半量上清液，并向細胞工廠內補充等量新鮮無血清培養基，調整參數為37℃、5% CO_2、5% O₂繼續培養，72h后收集細胞上清液。

5.根據權利要求1所述的一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：所述間充質干細胞因子的分離純化：將收集的間充質干細胞培養上清液放入離心管中，4℃，4000g離心8min，取上清，去除細胞沉渣；將上清液通過中空纖維濾膜過濾，收集濾液；將去沉渣后的濾液用移液管轉移至5KD超濾濃縮離心管中，4℃，4000g離心1.5-2h；收集濃縮后的液體至新的離心管中，4度冰箱儲存；將初步濃縮后的所有提取液轉移至超濾管中，進一步濃縮1.5-2h ；棄掉超濾管下面的液體；加鹽水重復超濾離心洗滌一次，收集濃縮液得臍帶間充質干細胞旁分泌因子濃縮原液。

6.根據權利要求1所述的一種人臍帶間充質干細胞旁分泌因子凍干粉的制備方法，其特征在于：間充質干細胞因子凍干粉制備為：將間充質干細胞旁分泌因子濃縮原液用生理鹽水稀釋，用注射器抽取濃縮原液，0.22um濾器過濾除菌，加入終濃度10wt.％甘露醇、2wt.%海藻糖、3 wt.%右旋糖酐、2 wt.%人血白蛋白、0.2 wt.%甘氨酸、2 wt.%氨基乙酸和0.4wt.%抗壞血酸的凍存保護劑，調節蛋白濃度至1mg/ml，混勻；按照3ml/支分裝到無菌、無熱原西林瓶，于壓強70Pa，溫度40℃的凍干條件下凍干36h，凍干結束，真空壓蓋，西林瓶取出，即制備得到人源間充質干細胞旁分泌因子凍干粉。