[發(fā)明專(zhuān)利]有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法及其試紙條和制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810160607.4
• 申請(qǐng)日: 2018-02-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110196322A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮銳;王丁力;龍飛;方鐵錚;楊凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東志道醫(yī)藥科技有限公司;廣州漢騰生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/558
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/558;G01N33/532;G01N21/78
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)，重組人乙酰膽堿酯酶純化后用膠體金進(jìn)行標(biāo)記，農(nóng)藥完全抗原與農(nóng)藥小分子競(jìng)爭(zhēng)性地與重組人乙酰膽堿酯酶結(jié)合；

(2)將膠體金標(biāo)記的重組人乙酰膽堿酯酶、農(nóng)藥完全抗原、重組人乙酰膽堿酯酶抗體等組裝成有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)試紙條；所述試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、檢測(cè)線(xiàn)、控制線(xiàn)、硝基纖維素膜、吸水墊、PVC底板組成；

(3)需要檢測(cè)的樣品經(jīng)前處理后，用提取溶劑提取，得到樣品溶液，將適量樣品溶液滴加到樣品墊上，樣品溶液將會(huì)向吸水墊端移動(dòng)；

待3～15分鐘后，根據(jù)檢測(cè)線(xiàn)和控制線(xiàn)的顯色情況，判斷樣品中是否含有有機(jī)磷類(lèi)或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留，判斷方法如下：

1)檢測(cè)線(xiàn)顯紅色，控制線(xiàn)顯紅色——陰性結(jié)果，樣品中不含有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥；

2)檢測(cè)線(xiàn)不顯紅色，控制線(xiàn)顯紅色——陽(yáng)性結(jié)果，樣品中含有有機(jī)磷類(lèi)或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥；

3)無(wú)論檢測(cè)線(xiàn)顯不顯紅色，控制線(xiàn)不顯紅色——試紙條失效；

其中步驟(2)中，所述試紙條也可以將上述的金標(biāo)墊去除，將膠體金標(biāo)記的重組人乙酰膽堿酯酶以固體或液體存放于容器中；

其中步驟(3)中，也可以將適量樣品溶液滴加到重組人乙酰膽堿酯酶容器中，充分混合，將不含金標(biāo)墊的試紙條插入容器中。

2.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(1)中，所述動(dòng)物細(xì)胞為CHO-DG44。

3.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(1)中，所述重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)的方法如下：根據(jù)人的乙酰膽堿酯酶的氨基酸序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化、信號(hào)肽和標(biāo)簽修改等技術(shù)對(duì)基因加以適當(dāng)改動(dòng)，設(shè)計(jì)合成乙酰膽堿酯酶新的基因片段AChE，將新設(shè)計(jì)的AChE基因融合至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pMPT中，轉(zhuǎn)染至CHO-DG44細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞池，此細(xì)胞能夠生產(chǎn)和表達(dá)與天然人乙酰膽堿酯酶具有相同生物活性的重組人乙酰膽堿酯酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(1)中，所述重組人乙酰膽堿酯酶的純化，包括以下步驟：離心取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，過(guò)濾除去不溶顆粒物后，以鎳柱捕獲其中的重組人乙酰膽堿酯酶，以含有梯度濃度咪唑的緩沖液洗脫結(jié)合在鎳柱上的重組人乙酰膽堿酯酶，以透析或其他方法除去重組人乙酰膽堿酯酶溶液中的咪唑，將重組人乙酰膽堿酯酶溶液濃縮至所需濃度。

5.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(1)中，所述農(nóng)藥完全抗原由小分子半抗原與BSA或OVA偶聯(lián)制得，其中小分子半抗原可以是修飾或未修飾的有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥小分子、修飾或未修飾的氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥小分子、有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥通用半抗原、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥通用半抗原。

6.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：

步驟(2)中，所述重組人乙酰膽堿酯酶抗體由上述重組人乙酰膽堿酯酶免疫鼠、兔、羊等動(dòng)物制得。

7.根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1所述的有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(3)中，所述提取溶劑為含0％～20％乙醇的pH為6～8的PBS緩沖液。