[發明專利]一種基于引物生成型滾環擴增技術的端粒酶活性檢測方法

在審

• 申請號: 201810160144.1
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108359716A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 張春陽;馬飛;魏樹花
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/48
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明提供一種基于引物生成型滾環擴增(PG?RCA)技術的端粒酶活性檢測方法，設計一個探針，端粒酶存在時，探針3'端不斷增加端粒(TTAGGG)_n擴展，并與反向引物結合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下啟動SDA反應并生成RCA引物，RCA引物和圓形模板(CT)結合，在phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI切割酶作用下觸發線性RCA反應并生成新RCA引物，新RCA引物又與新CT結合，觸發新一輪RCA反應，最終產生大量核酸擴增產物，被熒光染料SYBR Gold檢測。該方法將檢測信號兩步放大具有超高的靈敏度，檢測限低至3個Hela細胞，操作簡單，無需繁瑣的洗滌分離步驟。

技術領域

本發明屬于生物分析技術,特別涉及一種基于端粒觸發鏈置換放大介導的引物生成型滾環擴增反應檢測端粒酶活性的熒光方法。

背景技術

端粒是真核染色體末端的一種特殊結構，由串聯重復(TTAGGG)n組成。在正常的體細胞中，端粒長度在每個細胞分裂過程中都逐漸縮短。一旦端粒被縮短到一個臨界長度，細胞衰老、凋亡和老化就不可避免地發生。這種端粒長度的縮短可以被端粒酶通過增加重復序列(TTAGGG)n到端粒末端來阻斷。大量的研究表明，在正常的人類細胞中端粒酶活性降低或缺失，但在幾乎所有癌癥細胞(超過85％)中被高度激活，如肺癌，肝癌，胃癌，和結腸直腸癌。因此，端粒酶被認為是早期癌癥診斷的潛在生物標志物。此外，端粒酶也是治療癌癥的重要靶標，各種各樣的抑制端粒酶活性的化合物已經被開發成抗癌藥物。因此，端粒酶的有效檢測對生物研究和生物醫學應用都具有重要的意義。

現有方法中，基于聚合酶鏈反應(PCR)的端粒重復擴增方法(TRAP)是最常用的檢測端粒酶活性的方法，但是程序耗時、放射性材料污染、不實用是其無法克服的缺點。近年來又開發了一些新的方法來檢測端粒酶的活性，例如等溫核酸擴增法，電化學分析法，電化學發光檢測法和以及熒光分析法。等溫核酸擴增方法大大提高了實驗的簡單性，但其檢測靈敏度不高，在優化條件下，可以檢測低至50個癌細胞中的端粒酶活性；電化學分析法中，有報道指出，Lin等開發了一種基于免標記的電化學阻抗法來檢測端粒酶活性，該檢出限能夠測定1000HeLa細胞中端粒酶的活性；電化學發光檢測技術集合了電化學方法與化學發光法兩者的優點，Xu等研發的一種電化學發光分析方法來分析端粒酶的活性，可以達到最低檢測313個HL-60癌細胞，之后Xu等優化了該方法又設計了一種新穎的雙電位ECL信號檢測方法，其檢測最低100個HL細胞提取的端粒酶活性；熒光分析法中，Majerska等設計了一種新穎的不需要使用放射性材料和高純度端粒酶樣品的免PCR端粒酶分析法—一種基于等溫循環鏈置換聚合反應的熒光分析法，最低可檢測到40個HeLa細胞中的提取的端粒酶活性。由此可見，上述方法均存在靈敏度有限的問題，因此，開發一種新的方法用于快速檢測、靈敏、特異性的檢測端粒酶活性的方法是目前急需解決的問題。

發明內容

為了克服上述技術中存在的不足，本方法提供一種基于端粒酶觸發鏈置換放大介導的引物生成型滾環擴增技術(PG-RCA)檢測端粒酶活性的方法。本發明將高效率的恒溫指數擴增方法和滾環擴增方法相結合，將檢測信號進行了兩步放大，具有超高的靈敏度，因此本方案可以實現高效、靈敏地檢測端粒酶的活性，檢測限低至3個Hela細胞，并可特異性地區分端粒酶和其它蛋白；另外，本發明通過一個特殊探針將滾環擴增的引物自動生成，無需再單獨設計滾環擴增引物，操作簡單；整個操作過程無需繁瑣的洗滌、分離步驟。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一個方面，提供一個DNA單鏈探針在引物生成型滾環擴增(PG-RCA)技術檢測端粒酶活性中的應用，所述探針列SEQ ID NO.1為：5'-AAC TAT ACA ACC TAC TACCTC ACC TCA GCT ACA ATC CGT CGA GCA GAG TT-3'；

該探針3'端為端粒酶底物序列，5'端為RCA底物序列，中間包含切割酶識別位點。