[發明專利]一種基于引物生成型滾環擴增技術的端粒酶活性檢測方法

在審

• 申請號: 201810160144.1
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108359716A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 張春陽;馬飛;魏樹花
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/48
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.一種探針在基于引物生成型滾環擴增技術檢測端粒酶活性方法中的應用，其特征在于,所述探針序列為SEQ ID NO.1。

2.一種基于引物生成型滾環擴增技術檢測端粒酶活性的方法，其特征在于,步驟如下：

(1)待測端粒酶誘導的引物生成型滾環擴增反應：DNA單鏈探針中加入待測端粒酶、反向引物，三磷酸脫氧核糖核苷酸、DNA聚合酶和切割酶，圓形模板，SYBR Gold，在緩沖液中孵育；

(2)分光光度計檢測；

所述探針序列為SEQ ID NO.1，所述反向引物序列為SEQ ID NO.2，所述圓形模板序列為SEQ ID NO.3。

3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述引物序列SEQ ID NO.1 3'端為端粒酶底物序列，5'端為滾環擴增底物序列，中間包含切割酶識別位點。

4.如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，DNA聚合酶為phi29 DNA聚合酶，所述切割酶為Nb.BbvCI切割酶；圓形模板含有一個Nb.BbvCI切割酶的識別位點。

5.如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中，緩沖液包括20mmol/LTris-HCl(pH 8.5),5mmol/L氯化鎂，10mmol/L硫酸銨,20mmol/L氯化鉀,1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐溫20；孵育條件為在35℃下孵育120min。

6.一種基于引物生成型滾環擴增(PG-RCA)技術檢測端粒酶活性的試劑盒，包括：20nmol/L探針；20nmol/L反向引物；10nmol/L的圓形模板；1U DNA聚合酶；0.2U切割酶；0.75mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷酸；所述探針序列為SEQ ID NO.1，所述反向引物序列為SEQ ID NO.2，所述圓形模板序列為SEQ ID NO.3。

7.如權利要求6所述的試劑盒,其特征在于，所述DNA聚合酶為phi29DNA聚合酶，所述切割酶為Nb.BbvCI切割酶。

8.如權利要求6所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括：緩沖液，所述緩沖液包括20mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)，5mmol/L氯化鎂，10mmol/L硫酸銨，20mmol/L氯化鉀，1mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸，0.05％(v/v)吐溫20。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括1×SYBR Gold。

10.如權利要求8或9任一項所述的試劑盒在檢測端粒酶活性中的應用。