[發(fā)明專利]一種口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810160047.2
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108387741A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏婕;魏玉榮;苗書魁;汪萍;郭會玲;米曉云;薛英;王延;馬文戈;黃炯;薛晶
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577;G01N33/535
• 代理公司: 西安研創(chuàng)天下知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61239
• 代理人: 楊鳳娟

本發(fā)明公開了一種口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測方法及試劑盒，該試劑盒包括3B蛋白包被的檢測板、工作濃度的兔抗牛HRP酶標抗體、陰性對照、陽性對照、TMB顯色液、1N鹽酸。本發(fā)明可準確、快速檢測出動物血清中3B抗體有無，用于檢測動物血清中口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3B抗體，適用于動物群體感染狀況監(jiān)測和評估、發(fā)現(xiàn)早期隱性感染和進出境檢疫，不受血清型的限制。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)

FMD是由FMDV引起的偶蹄類動物烈性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入必須通報的動物疫病。該病傳播快、宿主范圍廣、發(fā)病率高，對畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成極大威脅。近年來我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，口蹄疫是重大的潛在威脅。與發(fā)達國家通常采取的撲殺政策不同，發(fā)展中國家普遍采用免疫的方法來控制該病。因此，如何快速、可靠地區(qū)分免疫動物和感染動物，對于FMD的防制以及國際貿(mào)易尤為重要。基于動物感染FMDV后，既能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體，又能產(chǎn)生NSP抗體，而疫苗免疫動物主要誘導(dǎo)機體產(chǎn)生FMDV結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與結(jié)構(gòu)蛋白相比，非結(jié)構(gòu)蛋白的變異較少，相對保守。在FMD診斷中，區(qū)分免疫動物和自然感染動物是一項十分重要的內(nèi)容，鑒別自然感染動物和免疫動物也是OIE判定一個國家有無FMD流行的依據(jù)。近年來，陸續(xù)建立了檢測FMDVNSP抗體的診斷方法，以區(qū)分FMDV感染動物和注射疫苗動物。

FMDV的NSP是指除了衣殼蛋白1A、1B、1C、1D和它們的前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及它們的前體。ＦＭＤＶ的３Ｂ蛋白是由非結(jié)構(gòu)蛋白Ｐ３編碼區(qū)３個相連的但不完全相同的基因編碼，大小分別為６９ｂｐ、７２ｂｐ、７２ｂｐ并產(chǎn)生３種不同的３Ｂ蛋白（ＶＰｇ１～３），此現(xiàn)象在ＲＮＡ病毒中少見。ＶＰｇ蛋白參與ＲＮＡ病毒的起始合成和衣殼的形成。由于ＶＰｇ攜帶有ｐＵｐＵ結(jié)構(gòu)與新合成的子代ＲＮＡ相連，所以ＶＰｇ被認為是小ＲＮＡ病毒ＲＮＡ合成的引物。這種特殊的ＲＮＡ復(fù)制方式與宿主ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄不同。因而，在宿主ＲＮＡ合成受到抑制時，并不影響ＦＭＤＶ ＲＮＡ的合成。ＶＰｇ基因的拷貝數(shù)與ＲＮＡ病毒的感染力呈正相關(guān)，ＶＰｇ突變將導(dǎo)致病毒生命周期延長，這也意味著聚合蛋白的合成和加工被推遲，感染性粒子數(shù)目減少。目前，關(guān)于ＦＤＭＶ ３Ｂ蛋白的研究較少，它在病毒復(fù)制過程中的作用，及和宿主的相互作用還沒有被完全揭示。而到目前為止，并未有口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測試劑盒的研究報道和專利申請。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種設(shè)備簡單，操作方便的口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測方法及試劑盒。以3B抗原包被酶標板條，兔抗牛HRP酶標抗體，定性檢測動物牛血清中的3B抗體。

具體技術(shù)方案為：

一種口蹄疫病毒3B蛋白抗體的ELISA檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、以含O型Akesu/58-2毒株3B基因的pCAGGS-3B質(zhì)粒為模板,擴增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a(+)載體,進行原核表達及純化。分別以Akesu/58-2型口蹄疫病毒、純化的3B蛋白為抗原；

步驟2、將3B標準蛋白用0.05mol/l pH9.5的碳酸鹽溶液(CBS)稀釋成1.5mg/ml,4℃16h包被酶標板,封閉液為含1%明膠;根據(jù)待測樣品數(shù)量取出所需酶標板并標記對照孔和樣品孔,樣品孔加入工作濃度的兔抗牛HRP酶標抗體和待測病毒培養(yǎng)液各100ul(對照孔加PBST),4℃孵育24h后移入酶標板上相應(yīng)的孔中,37℃孵育45min后用PBST洗3次;

步驟3、每個樣品孔加入工作濃度的酶標二抗, 37℃孵育45min,PBST洗5次后加入底物,室溫反應(yīng)10min,加入終止液終止反應(yīng)。用酶標儀讀取各孔OD值;結(jié)果判定,根據(jù)各樣品的B/Bo在標準曲線上求出其對應(yīng)的質(zhì)量濃度,或代入回歸方程計算樣品質(zhì)量濃度的對數(shù)值X,求其反對數(shù),即為樣品中所含3B蛋白的質(zhì)量濃度。