[發明專利]一種鑒別滇重樓正品及不同基因型的試劑盒、鑒別方法

有效

• 申請號: 201810159772.8
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108265123B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 尹鴻翔;唐卓;張開元;陳蓉
• 申請（專利權）人: 成都中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;劉華玲

本發明提供了一種鑒別滇重樓正品及不同基因型的試劑盒，它包含1～2對引物，引物對選自：SEQ ID NO：1～2所示的引物對1，SEQ ID NO：3～4所示的引物對2。本發明還提供了所述試劑盒的用途及一種快速鑒別滇重樓的方法。本發明提供的試劑盒和方法，可以準確、有效的鑒別滇重樓2種基因型，并將滇重樓與其他同屬近緣易混種區分開，而且操作簡單，成本低，在滇重樓藥材和飲片的真偽鑒別，滇重樓人工栽培的種子種苗質量控制中值得推廣，應用前景良好。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種鑒別滇重樓正品及不同基因型的試劑盒、鑒別方法。

背景技術

重樓Paris L.為百合科多年生草本植物，藥用歷史悠久，以“蚤休”之名始載于《神農本草經》，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚之功效，可用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐的治療，是很多著名中成藥如云南白藥、宮血寧膠囊、抗病毒顆粒等的重要原料。

發明人對我國西南地區重樓人工種植基地的考察發現，由于重樓栽培正處于野生變家種的階段，種苗的生產和貿易缺乏行業規范，來源混亂，人工栽培品種中，滇重樓(P.polyphylla var.yunnanensis)是產區最主要的栽培品種，種植規模最大，除此之外，還包括七葉一枝花(Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara)、多葉重樓(P.polyphylla var.polyphylla)，狹葉重樓(P.polyphylla var.stenophylla)，南重樓(P.vietnamensis)，五指蓮(P.axialis var.axialis)，平伐重樓(P.vaniotii)，球藥隔重樓(P.fargesii)，黑籽重樓(P.thibetica var.thibetica)，長柱重樓(P.forrestii)等多個近緣類群，品種十分混亂。

同屬近緣種的混用情況一直是影響中藥材質量的一個重要因素，重樓作為典型的“同屬多基源”品種更是如此。重樓以根莖入藥，根據性狀及顯微等特征對各近緣混用種藥材難以進行有效區分。鑒于重樓屬不同種在藥用成分甾體皂甙的種類、含量等方面存在顯著的差異，療效也有很大差異，不同品種的重樓混用將給中醫產業的質量控制帶來極大的安全隱患。因此，對滇重樓及其混用近緣種進行有效區分，在藥材生產和貿易中建立一種快速、準確的鑒別方法，對于重樓的用藥安全、質量控制以及重樓屬中瀕危種群的保護都有著十分重要的意義。

隨著分子生物學迅速發展，植物在DNA水平上的多樣性研究取得突破性進展，用于藥用植物的分子鑒定技術也日漸完善。陳中蘇直等(基于SSR分子標記的滇重樓遺傳多樣性研究，中草藥，2017，48(09):1834-8)采用SSR分子標記對滇重樓5個不同居群115份樣品進行遺傳多樣性分析時發現，利用UPGMA聚類分析可將5個居群分為2大類，且相對遺傳距離較遠，發明人前期研究也驗證了滇重樓序列的種內差異較大。但目前對不同類別的滇重樓鑒別方法復雜，需要進行產物回收測序再聚類分析等步驟，操作復雜，而且測序成本高。

另外，已有的報道中，研究者們均是通過DNA條形碼序列對重樓屬品種進行鑒定，將滇重樓與其它同屬近緣種進行鑒別(見朱英杰，重樓屬DNA條形碼篩選與鑒定方法的研究[D]，西南交通大學，碩士，2010；姜藜等，基于ITS全序列分析的重樓常見混偽品鑒定研究[J]，中國新藥雜志，2013，22(20)：2439～2444)，同樣需要在PCR反應后進行產物回收測序等步驟，不利于推廣應用。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種鑒別滇重樓正品及不同基因型的試劑盒、鑒別方法。

本發明提供了一種鑒別滇重樓正品及不同基因型的試劑盒，它包含1～2對引物，引物對選自：SEQ ID NO：1～2所示的引物對1，SEQ ID NO：3～4所示的引物對2。

SEQ ID NO：1～2所示的引物對1：YN-IF2，YN-IR2。