[發明專利]一種檢測心型脂肪酸結合蛋白的試劑盒

在審

• 申請號: 201810158547.2
• 申請日: 2018-02-26
• 公開（公告）號: CN108490186A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 王賢俊;鄭蓓蕾
• 申請（專利權）人: 王賢俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 溫州名創知識產權代理有限公司 33258
• 代理人: 陳加利

1.一種檢測心型脂肪酸結合蛋白的試劑盒，其特征在于：試劑盒包括由試劑1和試劑2組成的液體雙試劑組分，其中

所述試劑1成分如下：

磷酸鹽緩沖液pH6.0-7.0 0.1-0.5mol/L

聚乙二醇8000 9-15g/L

疊氮鈉 0.01wt％

所述試劑2成分如下：

所述試劑1與試劑2的體積比為3:1。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的h－FABP抗體片段復合膠乳顆粒的通用以下方法制備：運用抗體片段化技術，在含半胱氨酸的緩沖環境下，先由無花果蛋白酶對h－FABP抗體進行切割，形成h－FABP抗體F(ab')2片段和Fc的多肽碎片，經Protein A離心柱洗脫純化，去除Fc的多肽碎片，獲得純化的h－FABP抗體F(ab')2片段，再將h－FABP抗體F(ab')2片段交聯于羧基膠乳微球上，形成h－FABP抗體片段復合膠乳顆粒。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，包括如下步驟：

(1)由無花果蛋白酶將h－FABP抗體切割成F(ab')2片段；

將鼠抗人h－FABP抗體用離心式去鹽柱脫鹽，所用緩沖液為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)；取相同的磷酸鹽緩沖液20ml，加入無花果蛋白酶1mg，1mol/L半胱氨酸溶液1ml，0.5mol/L EDTA溶液1ml，置于37℃，100r/min恒溫水浴搖床中均勻溶解2h；過Sephadex G50柱，并用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進行洗脫，收集獲得含活化的無花果蛋白酶酶溶液，并濃縮至原體積；以體積比5：1混合透析后的鼠抗人h－FABP抗體與活化無花果蛋白酶酶溶液，置于37℃，100r/min恒溫水浴搖床中酶解3h，3h后再次加入等量的活化無花果蛋白酶酶溶液繼續酶解3h，重復三次；酶解結束后加入0.1mmol/L碘乙酰胺0.5ml冰浴1h終止反應；過Protein A離心柱，并用含0.1mol/LNaCl的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進行洗脫，最后用超純水透析24h，收集獲得h－FABP抗體F(ab')2片段，置于2-8℃保存；

(2)將F(ab')2片段交聯于羧基膠乳微球上，形成h－FABP抗體片段復合膠乳顆粒；

取粒徑為120nm濃度為10％膠乳微球1ml，加入0.2mol/L、pH6.5的磷酸鹽緩沖液9ml，室溫震蕩2mins，混合均勻后迅速加入120μl EDC水溶液(50mg/ml)，加入150μl N-羥基硫代琥珀酰亞胺水溶液(100mg/ml)，室溫攪拌40min，2-8℃離心30min(轉速15000rpm)，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)洗滌三次，除去上清液，沉淀用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)1ml超聲重懸；取0.5mlh－FABP抗體F(ab')2片段，加入0.5ml膠乳微球重懸液，室溫攪拌1h，再重復加入0.5ml膠乳微球重懸液，繼續室溫攪拌3h，加入400μl 5％鹽酸羥胺水溶液淬滅試劑和200μl 1％BSA水溶液，室溫震蕩1h；4℃離心30min(轉速15000rpm)，沉淀用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)洗滌三次，除去上清液，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)1ml超聲分散30min，2-8℃密封保存。