[發(fā)明專利]基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810156947.X
• 申請日: 2018-02-24
• 公開（公告）號: CN108085395A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設計）人: 韓林志;肖芳
• 申請（專利權）人: 韓林志
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的引物組。所述引物組為用于特異性擴增十個目標擴增子的引物組合，包括分別針對FAM19A4、miR124?2、C13ORF18、EPB41L3、JAM3、SST、ZIC1、GHSR、GFRA1及ANKRD18CP擴增子的上游引物及下游引物。本發(fā)明涉及一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的試劑盒。所述試劑盒包括含有上述引物的PCR多重擴增反應液。本發(fā)明還涉及一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的方法。本發(fā)明提供的試劑盒及其檢測方法具有多基因甲基化聯(lián)合檢測優(yōu)勢、靈敏性高、特異性好、通量高、檢測時間快速的優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及體外診斷技術領域，特別的，涉及一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的引物組、試劑盒及方法。

背景技術

宮頸癌一直是困擾女性的重要惡性腫瘤。正常的宮頸細胞經過癌前病變發(fā)展成為宮頸癌，可能長達幾十年。在這整個過程中部分HPV病毒的感染可被自身免疫系統(tǒng)修復而自動轉歸為正常，而另外一部分與宮頸癌聯(lián)系更緊密的癌前病變則需及時進行干預來阻止癌前病變發(fā)展成為宮頸癌。目前我國臨床上應用的主要篩查手段為中國女性的健康做出巨大貢獻的同時也都存在其不可避免的缺陷。

首先，目前的方法是沿用了大半個世紀的細胞學檢測方法，包括巴氏涂片法及近十多年發(fā)展起來的液基細胞學(TCT)。因為整個檢測流程中從取樣、抹片制備、觀察、結果判讀多個環(huán)節(jié)受到人為影響的可能性較大，造成漏檢的幾率較高。

其次，自從宮頸癌歸因于HPV病毒持續(xù)感染后發(fā)展起來的HPV-DNA檢測。因為其檢測的僅僅是HPV病毒的存在與否，而HPV病毒的存在，大部分是一過性的，也就是意味著這些被自體免疫清除掉的HPV感染也會被判定為陽性，導致過度治療。

所以，發(fā)明人期望從傳統(tǒng)的形態(tài)病理向深層次的分子病理發(fā)展，從僅僅檢測治病病毒的感染與否向檢測是否真正發(fā)生了病變發(fā)展，從以上角度挖掘出能與癌前病變緊密相關的分子病理的變化指標，以指示患癌的風險。

大量研究證明，隨著宮頸癌病變進展，宿主相關細胞的甲基化水平升高。宮頸癌基因甲基化檢測，就是通過檢測患者自身宮頸細胞中DNA甲基化水平，與細胞學和HPV檢測聯(lián)合應用，可更加準確的預判患者患癌風險、進行早期篩查、做好分流管理和術后追蹤，進一步為婦女健康保駕護航。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶的作用下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共價結合到DNA分子的胞嘧啶(C)堿基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而并不改變DNA的序列。研究表明，F(xiàn)AM19A4、miR-124-2基因啟動子甲基化與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關，是宮頸癌特異的分子標記物。因此，檢測宮頸癌FAM19A4、miR-124-2基因啟動子的甲基化狀態(tài)，對宮頸癌的間接診斷、治療、預后判斷等方面具有重要意義。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，測序成本的降低，使測序技術逐漸成為基礎生物學研究和醫(yī)學檢測的常規(guī)實驗方法。但全基因組測序結構復雜，數據量大，周期長，費用高，限制了它的發(fā)展。擴增子測序(Amplicon Sequencing)是只對目標區(qū)域進行測序研究的一項測序方法。通過設計感興趣的基因組區(qū)域的引物，進行PCR擴增，對目標區(qū)域進行富集，然后針對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行建庫，高通量測序，分析序列中的變異。擴增子測序能根據研究者目的，針對目標區(qū)域進行高覆蓋度的測序，還可以檢測到低頻突變。采用擴增子測序，研究者可以對基因組中感興趣的關鍵區(qū)域進行重點研究。這種高針對性的方法可以高效的發(fā)現(xiàn)、驗證及篩選關注區(qū)域的基因組變異。相比全基因組測序，擴增子測序對目標區(qū)域有更準確快速的研究，適用于大量樣本的特定基因組區(qū)域研究。