[發(fā)明專利]基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的引物組、試劑盒及方法

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• 申請日: 2018-02-24
• 公開（公告）號: CN108085395A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發(fā)明（設計）人: 韓林志;肖芳
• 申請（專利權）人: 韓林志
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的引物組，其特征在于，包括分別針對如SEQ ID NO.1所示FAM19A4擴增子、如SEQ ID NO.2所示miR124-2擴增子、如SEQ IDNO.3所示C13ORF18擴增子、如SEQ ID NO.4所示EPB41L3擴增子、如SEQ ID NO.5所示JAM3擴增子、如SEQ ID NO.6所示SST擴增子、如SEQ ID NO.7所示ZIC1擴增子、如SEQ ID NO.8所示GHSR擴增子、如SEQ ID NO.9所示GFRA1擴增子及如SEQ ID NO.10所示ANKRD18CP擴增子的引物組合，其中：

FAM19A4上游引物：如SEQ ID NO.11所示，

FAM19A4下游引物：如SEQ ID NO.12所示，

miR124-2上游引物：如SEQ ID NO.13所示，

miR124-2下游引物：如SEQ ID NO.14所示，

C13ORF18上游引物：如SEQ ID NO.15所示，

C13ORF18下游引物：如SEQ ID NO.16所示，

EPB41L3上游引物：如SEQ ID NO.17所示，

EPB41L3下游引物：如SEQ ID NO.18所示，

JAM3上游引物：如SEQ ID NO.19所示，

JAM3下游引物：如SEQ ID NO.20所示，

SST上游引物：如SEQ ID NO.21所示，

SST下游引物：如SEQ ID NO.22所示，

ZIC1上游引物：如SEQ ID NO.23所示，

ZIC1下游引物：如SEQ ID NO.24所示，

GHSR上游引物：如SEQ ID NO.25所示，

GHSR下游引物：如SEQ ID NO.26所示，

GFRA1上游引物：如SEQ ID NO.27所示，

GFRA1下游引物：如SEQ ID NO.28所示，

ANKRD18CP上游引物：如SEQ ID NO.29所示，

ANKRD18CP下游引物：如SEQ ID NO.30所示。

2.一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，包括含有如權利要求1所述的上游引物及下游引物的PCR多重擴增反應液，所述PCR多重擴增反應液包括：AmpliSeq HiFi Mix、如權利要求1所述的SEQ ID NO.11-30引物依次等比混合組成的AmpliSeq Primer Pool及無核酸酶水。

3.根據權利要求2所述的基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，所述PCR多重擴增反應液的終成分為：2×AmpliSeq HiFi Mix 10μl、AmpliSeqPrimer Pool 2μl、目標基因組DNA 40ng-70ng、其余無核酸酶水補足至20μl；其中AmpliSeqPrimer Pool為SEQ ID NO.11-30引物依次按摩爾比1:1:2:2:1:1:4:4:2:2:1:1:2:2:4:4:2:2:2:2混合組成。

4.根據權利要求2-3中任一所述的基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的試劑盒，其特征在于，還包括陽性對照品及陰性對照品，所述陽性對照品為宮頸癌細胞株CaSki，所述陰性對照品為宮頸癌細胞株C33A。

5.一種基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：取待檢測樣本抽提的DNA，對其進行轉化處理，轉化后的DNA作為PCR的模板；

步驟二：提供如權利要求4所述的試劑盒，對所述模板進行PCR多重擴增，并在擴增產物兩端接上合適的接頭，完成目標擴增子測序文庫構建；

步驟三：對所述擴增子測序文庫進行質檢，進而對樣本的十個靶基因進行高通量測序分析，根據檢測結果對樣本進行判斷。

6.根據權利要求5所述的基于高通量測序的宮頸癌多基因甲基化檢測的方法，其特征在于，所述步驟一中轉化處理所采用的試劑為亞硫酸鹽；所述步驟二中PCR多重擴增反應程序為：99℃2min；25cycles，99℃15sec，60℃4min。