[發明專利]馬鈴薯植株葉斑類病害細極鏈格孢病原菌的分子檢測引物及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810154051.8
• 申請日: 2018-02-22
• 公開（公告）號: CN108192992A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 王曉丹;呂典秋;胡林雙;閔凡祥;楊帥;張靜華;高云飛;魏琪;董學志;王文重;馬紀
• 申請（專利權）人: 黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 賈澤純

馬鈴薯植株葉斑類病害細極鏈格孢病原菌的分子檢測引物及其檢測方法，它涉及馬鈴薯檢測領域，本發明為了解決目前傳統生物學方法針對馬鈴薯，很難在種間區分鏈格孢屬各種的問題，本發明的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示，利用上述引物對待測樣品進行PCR檢測，本發明的方法能夠快速，準確的鑒定細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)，檢測靈敏度為10pg/μL。

技術領域

本發明涉及馬鈴薯檢測領域，具體為馬鈴薯植株葉斑類病害鏈格孢屬(細極鏈格孢(Alternaria tenuissima))病原菌的分子檢測引物及其檢測方法。

背景技術

當前中國馬鈴薯的總面積和總產量躍居世界首位，但單產卻處于較低水平，各種病害頻發是造成馬鈴薯減產的主要原因之一。馬鈴薯病害中，以真菌病害種類最多，且具有傳播性，防控難，有的真菌還可發生變異，對馬鈴薯生產造成嚴重威脅。Alternaria是造成馬鈴薯植株和葉片病斑的一類重要真菌病原。據Zheng等(2015)報道，侵染中國馬鈴薯植株的Alternaria屬病原主要有三種：茄鏈格孢(Alternaria solani)、細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)和細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)，這三種病原分別造成了馬鈴薯早疫病、黑點病和黑斑病，均可導致植株葉片壞死、植株枯萎等癥狀，嚴重時也可侵染塊莖，從而造成減產。黑龍江省作為全國重要的馬鈴薯生產基地，Alternaria屬病原在馬鈴薯植株上的種類分布情況還鮮為報道，調查近年來黑龍江省馬鈴薯Alternaria屬病原的種類，對于有針對性地防治Alternaria屬病原造成的各類病害具有重要意義。

許多鏈格孢屬的不同小種都已經被分類，并表現出在種內或種間的生理、形態、基因和毒力變化。這可能是由于真菌菌絲體相互連接的橋梁作用可以促進營養、水分和信號分子的相互傳輸。許多像毒力分析、營養體親和性和分子生化分析的實驗方法都用來檢驗鏈格孢屬種間和種內的變化，詳細調查生長季節內鏈格孢屬種間、種內變化可以讓我們更好地了解不同年份間流行病學和管理病原。馬鈴薯早疫病、黑點病和黑斑病這三種病害在植株上的癥狀極其相似，在葉片上都可形成病斑，斑點形狀和顏色也非常類似，在田間這三種病原通常情況下為混合侵染，因此通過目測其癥狀很難判定這三種病害，此外，由于許多鏈格孢屬小種在顯微鏡下形態差異較小，所以傳統生物學方法很難在種間區分鏈格孢屬各小種。

發明內容

本發明為了解決目前傳統生物學方法針對馬鈴薯，很難在種間區分鏈格孢屬各種的問題，尤其是區分細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)的問題。而提供了馬鈴薯植株葉斑類病害細極鏈格孢病原菌的分子檢測引物及其檢測方法。

本發明的引物序列如序列表Seq ID No：1所示和Seq ID No：2所示。

本發明的馬鈴薯植株葉斑類病害細極鏈格孢病原菌的分子檢測方法，它是按照以下步驟進行的：

一、以提取待檢測的馬鈴薯基因組DNA為模板，采用權利要求1的引物，進行PCR擴增；

二、取PCR產物進行凝膠電泳檢測，若能夠檢測出240bp大小的片段，則可判斷出所檢測的馬鈴薯中存在細極鏈格孢病原菌。

本發明包含以下有以效果：

本發明利用設計的根據鏈格孢屬核糖體內轉錄間隔區ITSⅠ基因序列和組蛋白3(Histone3)基因保守序列設計的Alternaria屬(尤其是細極鏈格孢(Alternariatenuissima))引物進行PCR擴增，建立了一套快速、準確的可鑒定Alternaria屬病原的PCR鑒定技術，結合傳統生物學鑒定方法，調查分析黑龍江省馬鈴薯葉斑類病害Alternaria屬病原的組成和分布情況，以期為生產上有針對性地防治該類病害提供依據。

本發明的方法能夠快速，準確的鑒定細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)，檢測靈敏度為10pg/μL。