[發明專利]馬克斯克魯維酵母啟動子、分泌信號肽及其制備與應用

有效

• 申請號: 201810153537.X
• 申請日: 2018-02-22
• 公開（公告）號: CN108410870B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 呂紅;余垚;周峻崗
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N15/65;C12N15/66;C12N1/19;C12N9/18;C12R1/645;C12R1/865
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含馬克斯克魯維酵母啟動子和馬克斯克魯維酵母分泌信號肽；所述重組表達載體還包含馬克斯克魯維酵母自主復制序列、馬克斯克魯維酵母菊粉酶終止子基因序列和營養缺陷篩選標記基因序列；所述重組表達載體的核苷酸序列至少包括：

a)、如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；或

b)、如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體還包含與所述馬克斯克魯維酵母啟動子可操作地連接的目的基因。

3.根據權利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述目的基因為阿魏酸酯酶基因。

4.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含根據權利要求1-3中任何一項所述的重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌為酵母。

6.根據權利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述酵母至少包括馬克斯克魯維酵母屬酵母、乳酸克魯維酵母屬酵母或釀酒酵母屬酵母。

7.根據權利要求1所述的重組表達載體的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

步驟1、以馬克斯克魯維酵母菌FIM-1的基因組為模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的引物INU-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的引物INU-R1 PCR擴增菊粉酶基因；在反應體系中添加Taq酶，對PCR擴增產物進行加A，獲得目的片段；回收所述目的片段，與pMD18-T載體進行連接，得到含有馬克斯克魯維酵母菊粉酶啟動子的質粒pMD18-T-INU；所述馬克斯克魯維酵母菌FIM-1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10621；

步驟2、以所述質粒pMD18-T-INU為模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的引物INUΔ-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的引物INUΔ-R1將菊粉酶基因79-1668bp的序列去除，同時在菊粉酶基因的78bp之后和終止密碼子之間引入多克隆位點，得到質粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU；

步驟3、以所述質粒pMD18-T-P_INU-SP-MCS-T_INU為模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的引物INU-F2和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的引物INU-R2擴增P_INU-SP-MCS-T_INU片段；

步驟4、以pUKD載體為模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的引物pUKD-F1和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的引物pUKD-R1將pKS和KD序列之間的EcoRI位點去除，得到質粒pUKDΔE；利用EcoRI對所述質粒PUKDΔE進行酶切，回收酶切產物；

步驟5、將步驟3中的所述P_INU-SP-MCS-T_INU片段與步驟4中的所述酶切產物連接，得到質粒pUKDN132；

步驟6、以所述質粒pUKDN132為模板，利用核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的引物T(-351)A-F和核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的引物T(-351)A-R將菊粉酶基因起始密碼子上游351位的胸腺嘧啶脫氧核苷酸突變為腺嘌呤脫氧核苷酸，得到質粒pUKDN132-T(-351)A，包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

步驟7、以步驟6中得到的所述質粒pUKDN132-T(-351)A為模板，利用核苷酸序列如SEQID No.18所示的引物UTRΔA-F和核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的引物UTRΔA-R將菊粉酶基因起始密碼子上游8bp到上游115bp之間的序列去除，得到質粒pUKDN132-T(-351)A+UTRΔA，核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；或

步驟8、以步驟6中得到的所述質粒pUKDN132-T(-351)A為模板，利用核苷酸序列如SEQID No.20所示的引物P10L-F和核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的引物P10L-R將菊粉酶基因第29位的胞嘧啶脫氧核苷酸突變為胸腺嘧啶脫氧核苷酸，得到質粒pUKDN132-T(-351)A+P10L,核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。