[發明專利]一種改良賴氨酸脫羧酶、生產方法及其應用

有效

• 申請號: 201810150350.4
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN110157750B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發明（設計）人: 陳玲;劉修才
• 申請（專利權）人: 上海凱賽生物技術股份有限公司;CIBT美國公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N9/88;C12N15/60;C12R1/01
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 于寶慶;崔香丹

本發明涉及改良型賴氨酸脫羧酶、其生產方法以及利用其對賴氨酸進行脫羧的方法。

技術領域

本發明涉及改良型賴氨酸脫羧酶、其生產方法以及利用其對賴氨酸進行脫羧的方法。

背景技術

賴氨酸脫羧酶(lysine?decarboxylase,簡稱LDC,EC?4.1.1.18)廣泛存在于微生物、動物如昆蟲和高等植物中，其可以將L-賴氨酸脫去一個羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。1,5-戊二胺的用途相當廣泛，例如可以和二元酸進行聚合反應合成新型尼龍，在工業生產中具有很高的應用價值。目前，微生物法戊二胺生產主要采用以下兩種方法，微生物發酵生產和微生物體外酶催化生產戊二胺。

來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶CadA(或稱為誘導型LdcI)是由10個亞基(每個亞基大小約為80kDa)組成雙層、五瓣型的復合體(Kanjee,etal.,the?EMBO?Journal?30:931–944,2011；Kanjee?et?al.,Biochemistry?50,9388-9398,2011)。在較低pH條件下(5.0)，顯微鏡下觀察CadA會呈現多個10聚體疊在一起的狀態，而隨著pH逐漸升高(6.5左右)，這種多聚體會逐漸減少，相應的單獨的10聚體會逐漸增多，另外二聚體也會增加；至pH8.0左右時，大部分是以二聚體存在；對應的賴氨酸轉化活性會出現隨pH逐漸升高，活性逐漸降低的表型(Kanjee,et?al.,the?EMBO?Journal?30:931–944,2011；Kanjee?et?al.,Biochemistry50,9388-9398,2011)。隨著賴氨酸脫羧酶的表達及賴氨酸脫羧活性的發揮，將培養基中的賴氨酸脫羧生成CO₂和戊二胺，戊二胺會通過CadB轉運蛋白運到細胞外，這個反應的發生必然會使得培養條件pH的逐漸升高(Meng?et?al.,Journal?of?Bacteriology?174:2659–2669,1992；Snider?et?al.,Journal?of?Biological?Chemistry?281:1532–1546,2006)。

發明內容

本發明人發現，除了環境pH對賴氨酸脫羧酶活性的影響，在發酵過程中，環境溫度的變化也會對賴氨酸脫羧酶表達菌株造成很大的影響，雖然能夠利用發酵罐的控溫系統來調節溫度，但會造成能源的消耗，成本的增加。為此，本發明人經過創造性勞動提供了一種經濟、高效的改良型賴氨酸脫羧酶、其生產方法以及利用其對賴氨酸進行脫羧的方法。

具體的，第一方面，提供了一種利用表達改良型賴氨酸脫羧酶的宿主細胞對賴氨酸進行脫羧的方法，所述改良型賴氨酸脫羧酶具有SEQ?ID?NO：8或與其具有至少70％的序列同一性，例如至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同一性的序列，或者由SEQ?ID?NO：7或與SEQ?ID?NO：7具有至少70％同一性，例如至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同一性的序列編碼，所述方法包括使所表達的改良型賴氨酸脫羧酶與賴氨酸接觸的步驟。

第二方面，提供了一種賴氨酸脫羧酶的生產方法，所述方法包括培養含有核苷酸序列SEQ?ID?NO：7或與SEQ?ID?NO：7具有至少70％同一性，例如至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同一性的序列的宿主細胞。

在一些實施方案中，所述宿主細胞在30～42℃，例如30℃、42℃溫度下培養。

在一些實施方案中，所述宿主細胞中cadA基因起始密碼子上游序列SEQ?ID?NO:17被替換為SEQ?ID?NO:18。

在一些實施方案中，宿主細胞中轉化有質粒pCIB71-M。在一些實施方案中，賴氨酸脫羧反應在35～50℃，例如35℃、37℃、45℃、50℃溫度下進行。