[發明專利]一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法

有效

• 申請號: 201810149819.2
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN108300771B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 李志勇;高東微;劉津;李偉琦;李婷
• 申請（專利權）人: 廣州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6888
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉婉

本發明提供了一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法，其采用雙通道檢測法，利用數字PCR系統同時探測狐特異性物種基因和高等動物特異性基因兩種熒光信號，將狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列檢測的探針分別標記為FAM和VIC，通過在同一PCR反應體系中測得的狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列的拷貝數，計算得到狐源性成分占高等動物源性成分的相對含量。本方法可對肉制食品和/或飼料中的狐源性成分占總肉源性成分的拷貝數比例進行相對定量。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種對狐源性成分進行定量檢測的雙重數字PCR方法。

背景技術

2013年初席卷歐洲的“馬肉風波”將食品中動物源性成分摻假推向了風口浪尖，經濟利益驅動的食品摻假（economically motivated adulteration, EMA）成為了全球共同面臨的食品安全熱點問題。肉制食品中含有配料表無標識的肉類成分，特別是含有非食用肉類成分，成為EMA主要類型之一。“馬肉風波”中法國、德國、意大利等歐盟16個國家的牛肉產品都含有未經標識的馬肉成分。南非官方調查發現一些牛、羊肉制品中包括水牛肉、驢肉，甚至袋鼠肉、長頸鹿肉、斑馬肉等。我國在查處“問題羊肉”時也發現摻假羊肉涉及狐貍、水貂、駱駝、老鼠等動物肉。

狐在我國屬于最常見的皮毛養殖動物。狐肉是皮毛養殖的副產品，產量大，形態和味道與牛羊肉等食用肉類接近，常常出現在肉制食品摻假行為中。各級食品督查和打假行動中發現，狐肉冒充羊肉、牛肉進入食品消費市場。此外，養殖狐屠宰后剩余的骨、肉、頭、內臟等部分也會非法流向高蛋白飼料加工行業，冒充屠宰后的食用動物原料。

為保障食品和飼料安全，維護公平合法貿易，需建立食品和飼料中狐源性成分的定量測定方法，對肉制食品和飼料中的狐源性成分進行精準檢測，為執法監管和相關行業自律提供準確可靠的技術依據。

目前，食品和飼料中狐源性成分檢測局限于實時熒光PCR、普通PCR、瓊脂糖凝膠電泳等分子生物學檢測技術，未見能夠滿足行業需要的定量檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于針對以上要解決的缺點與不足，提供一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法，通過同時檢測狐和高等動物源性成分基因組單拷貝的雙重數字PCR方法，可對肉制食品和/或飼料中的狐源性成分占總肉源性成分的拷貝數比例進行相對定量。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法，其采用雙通道檢測法，利用數字PCR系統同時探測狐特異性物種基因和高等動物特異性基因兩種熒光信號，將狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列檢測的探針分別標記為FAM和VIC，通過在同一PCR反應體系中測得的狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列的拷貝數，計算得到狐源性成分占高等動物源性成分的相對含量。

優選地，本發明的方法包括以下步驟：

（1）提取含有狐源性成分的肉制品的動物組織基因組DNA；

（2）配制數字PCR反應體系；

（3）進行數字PCR反應；

（4）讀取和分析數字PCR反應結果；

（5）計算所述狐源性成分占總肉成分的相對含量

狐源性成分占總肉成分的相對含量

其中A為狐特異性基因拷貝數濃度，B為高等動物特異性基因拷貝數濃度；

優選地，所述數字PCR反應包括但不限于微滴數字PCR反應和芯片數字PCR反應。

優選地，所述步驟（1）中，采用試劑盒法提取所述肉制品中的動物組織基因組DNA。