[發明專利]一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法

有效

• 申請號: 201810149819.2
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN108300771B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 李志勇;高東微;劉津;李偉琦;李婷
• 申請（專利權）人: 廣州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6888
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 劉婉

1.一種狐源性成分定量檢測的雙重數字PCR方法，其特征在于：采用雙通道檢測法，利用數字PCR系統同時探測狐特異性物種基因和高等動物特異性基因兩種熒光信號，將狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列檢測的探針分別標記為FAM和VIC，通過在同一PCR反應體系中測得的狐特異性物種基因和高等動物特異性基因序列的拷貝數，計算得到狐源性成分占高等動物源性成分的相對含量；

所述方法包括以下步驟：

（1）提取含有狐源性成分的肉制品的動物組織基因組DNA；

（2）配制數字PCR反應體系；

（3）進行數字PCR反應；

（4）讀取和分析數字PCR反應結果；

（5）計算所述狐源性成分占總肉成分的相對含量

狐源性成分占總肉成分的相對含量，

其中A為狐特異性基因拷貝數濃度，B為高等動物特異性基因拷貝數濃度；

所述狐特異性基因的引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3所示，所述高等動物特異性基因的引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4、SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，采用試劑盒法提取所述肉制品中的動物組織基因組DNA。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述數字PCR反應為微滴數字PCR反應和芯片數字PCR反應中的任意一種。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，當數字PCR反應為微滴數字PCR反應時，所述微滴數字PCR反應體系為20μL，各組分如下：2×ddPCR預混液 10 μL；濃度為10 μmol/μL的引物各0.8 μL，濃度為10 μmol/μL的探針各0.4 μL，DNA模板2 μL，補水至20 μL。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，所述微滴數字PCR反應條件為：95℃，5min，1℃/s；94℃，15 s，1℃/s，60℃，1 min，1℃/s，共49個循環；98℃，10 min，1℃/s；12℃保存反應產物。