[發明專利]無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa及其制備方法

有效

• 申請號: 201810148983.1
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN108410900B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 王春鳳;劉瓊;姜延龍;劉永仕;楊桂連;劉晶
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

本發明公開了無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa，它是生物安全外源蛋白表達系統，以asd缺失株E.coli 6212/Δasd和alr缺失L.plantarum NC8/Δalr為宿主菌，將來源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.cremoris strain JM4）基因組上P23啟動子作為alr基因表達的啟動子，以pYA4545，pLP?1261 Inv，pSIP409PgsA’?IL?10，pSIP409PgsA’?EGFP為基礎載體，構建以表面蛋白（S_achoring）為錨定模型的營養互補篩選標記大腸桿菌?乳酸菌無抗錨定表達載體pLPSa，并以EGFP作為報告基因進行篩選及錨定表達驗證。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa及其制備方法。

背景技術

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）作為一種腸道宿主菌株可耐受胃內低pH值、高鹽的環境，最適生長溫度為30-37℃，能耐受10℃左右的低溫，但在45℃以上的環境中出現生長抑制，常見于奶油、肉類、蔬菜等制成的發酵食品并可從多數植物中分離得到，故因此得名。研究表明，植物乳桿菌符合美國食品與藥品管理局（FDA）的GRAS（Generally Recognized as Safe）規定以及歐洲食品安全局（EFSA）的安全資格認證（Qualified Presumption of Safety）標準，通常定殖于人和動物的消化道中并發揮益生作用，利用該菌株制成的微生態制劑能夠增強機體免疫力，可有效防止一些胃腸道疾病的發生。同時，該菌株也是良好的外源蛋白表達系統，以其作為口服藥用蛋白載體很大程度上解決了蛋白易在消化道中發生水解的問題，從而使多種口服藥用蛋白都能有效地發揮防治疾病的作用。

pSIP409系列質粒是植物乳桿菌特有的穿梭質粒載體，由于它具備pUC來源于大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和256rep來源于植物乳桿菌兩個復制子，因此它可以在大腸桿菌中復制并在植物乳桿菌中進行外源蛋白的表達。但該系列質粒載體使用了紅霉素抗性基因(erythromycin，EM)作為篩選標記，一旦抗性基因轉移到宿主染色體內，很可能產生嚴重的生物安全隱患，因此該系統潛在的應用價值受到了限制。另外，Nguyen等認為紅霉素在酸性條件下會發生降解，這對外源基因的誘導表達造成了不利的影響。紅霉素也會使菌體產生“生理應激”，從而影響目的基因表達。所以我們要用非抗生素篩選標記代替該載體的抗生素抗性基因并使改建后載體能在受體菌植物乳桿菌NC8/Δalr（L. plantarumNC8/Δalr）中穩定復制表達外源蛋白，從而使我們的乳酸菌制品達到對機體無害要求。

丙氨酸消旋酶（Alanine Racemase，alr）基因廣泛存在于原核生物基因組中，該基因可將L-丙氨酸轉化為D-丙氨酸，D-丙氨酸是細胞壁中重要的交聯成分，是菌株生長的必需物質，因此該酶對原核細胞的生長至關重要。雖然絕大多數微生物都含有兩種丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（Biosynthetic Alanine Racemase，alr)和代謝型（CatabolicAlanine Racemase，dadx/B），但對于乳酸乳球菌和乳酸桿菌來說，丙氨酸消旋酶由單一alr基因所編碼，alr基因缺失株在普通MRS培養基中不生長，只有在額外添加D-丙氨酸的培養基中生長。在選擇壓力下，帶有alr標記的質粒具有較高的穩定性，并且在絕大多數發酵培養基中不會出現D-丙氨酸。