[發明專利]無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa及其制備方法

有效

• 申請號: 201810148983.1
• 申請日: 2018-02-13
• 公開（公告）號: CN108410900B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 王春鳳;劉瓊;姜延龍;劉永仕;楊桂連;劉晶
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

1.無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa，其特征在于：它是用NdeI和HindⅢ雙酶切pLP-1261 Inv和SEQ ID NO.1所示的基因，將SEQ ID NO.1所示的基因插入pLP-1261 Inv，得載體pLPS，再用P23-alr-asd基因替換載體pLPS上紅霉素基因；所述的P23-alr-asd基因，其堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

2.無抗性植物乳桿菌錨定表達載體pLPSa的制備方法，其特征在于，它包括：

1）含有sig_peptide信號肽、S-層蛋白C-末端錨定序列S_achoring基因S制備

參照NCBI發布的嗜酸乳桿菌ATCC 4356的SlpA基因序列，將sig_peptide信號肽序列、S-層蛋白C-末端錨定序列保留，將中間部分基因序列用Linker和多克隆酶切位點SalI、XbaI、XhoI、EcoR I、KpnI替換，Linker和多克隆酶切位點序列為GGCACGATTGCGGCG GTCGACTCTAGA CTCGAG GAATTC GGTACC，人工合成SEQ ID NO.1所示的基因S；用NdeI和HindⅢ雙酶切將SEQ ID NO.1所示的基因插入pLP-1261 Inv，載體命名為pLPS；

2）P23-alr-asd基因制備

參照PYA4545載體asd基因序列，NCBI公布的P23啟動子和植物乳桿菌alr基因序列將asd基因，P23啟動子和alr基因串聯，獲得P23-alr-asd基因并人工合成，其堿基序列如SEQID NO.2所示；

3）用P23-alr-asd基因替換載體pLPS上紅霉素基因獲得無抗性篩選標記錨定表達載體pLPSa

用P23-alr-asd基因替換載體pLPS上紅霉素基因，由于載體上沒有合適的酶切位點線性化載體，所以采用PCR方法線性化載體和P23-alr-asd基因，參照pLPS基因序列設計引物，擴增去除紅霉素基因的5050bp片段LPS，引物如下：

LPS F：TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTG

LPS R：GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC

擴增P23-alr-asd基因的引物序列如下：

asd F：CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC

alr R：CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG；

以合成的P23-alr-asd基因為模板擴增含有同源手臂的P23-alr-asd基因，將LPS與P23-alr-asd無縫克隆連接，電轉化E.coli 6212/Δasd感受態細胞，鋪普通LB固體培養基，利用asd基因與宿主菌實現營養互補篩選陽性克隆，測序鑒定正確的質粒命名為pLPSa，并將pLPSa電轉化至L. plantarum NC8/Δalr，利用alr基因與L. plantarum NC8/Δalr營養互補篩選陽性克隆，構建出無抗性篩選標記錨定表達載體pLPSa。