[發(fā)明專利]一種胎鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取分離培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810147120.2
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號(hào): CN108060116B
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 計(jì)曉娟;趙曉東;何燦粲;李亞男;朱旭;楊海燕;龔婷;李麗玲;曹麗娜
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 重慶樂泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50221
• 代理人: 劉佳

本發(fā)明公開了一種胎鼠肺來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括將孕鼠的受孕子宮放入青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS中浸泡，取出胎鼠放入度青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS的平皿中，洗滌；取出肺組織放入PBS并破碎，用0.25％胰酶消化步驟以上中的破碎組織，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，離心分離，取其沉淀，用含生長因子和2％FBS的血清的EBM?2培養(yǎng)基懸起，以10⁶/ML細(xì)胞濃度接種于6孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)原代細(xì)胞生長融合達(dá)80?90％時(shí)，用0.25％的胰酶消化傳代培養(yǎng)，直至細(xì)胞呈現(xiàn)均一形態(tài)，完成培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)皮祖細(xì)胞提取分離培養(yǎng)方法，特別是涉及一種來源為胎鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取、分離和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS，簡稱“EPCS”)是血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，能定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，亦稱血管母細(xì)胞。機(jī)體缺血時(shí)，EPCS可從骨髓中動(dòng)員進(jìn)入外周血，到達(dá)缺血組織參與血管新生。把體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的EPCS輸入體內(nèi)，提高循環(huán)中EPCS的數(shù)量和質(zhì)量，可促進(jìn)缺血部位的血管新生。因此，EPCS移植成為了治療缺血性血管疾病的一條新思路。

對于內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取，文獻(xiàn)報(bào)道的主要是采集臍帶血或出生后不同年齡的動(dòng)物骨髓、外周血，通過密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，然后接種于特殊物質(zhì)包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。

內(nèi)皮祖細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵是探尋其理想的組織來源，但內(nèi)皮祖細(xì)胞募集、分離和培養(yǎng)的方法存在較大差異，并且得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量少、擴(kuò)增效率及細(xì)胞增殖較慢。而本發(fā)明采取新的來源途徑提取內(nèi)皮祖細(xì)胞，即采用胎鼠的肺組織為組織來源，為內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取分離、培養(yǎng)提供了一種新的切實(shí)可行的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種胎鼠肺來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取分離培養(yǎng)方法，本發(fā)明的方法采用胎鼠的肺組織為內(nèi)皮祖細(xì)胞的新來源，經(jīng)提取、分離、培養(yǎng)獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞。

本發(fā)明一種胎鼠肺來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取、分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)取胎鼠的肺臟，放入含有500U-1000U青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS中，并將肺組織破碎；

(2)用胰酶消化步驟(1)中的破碎組織；

(3)消化完后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)15-18H；

(4)然后取出非貼壁的細(xì)胞，離心，取其沉淀；

(5)將步驟(4)的沉淀用含生長因子和FBS的血清的EBM-2培養(yǎng)基懸起，以濃度接種于孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(6)每2-4天換一次液，當(dāng)原代細(xì)胞生長融合達(dá)80-90％時(shí)，用胰酶消化傳代培養(yǎng)，持續(xù)傳代直至細(xì)胞呈現(xiàn)均一形態(tài)即完成培養(yǎng)。

上述本發(fā)明的方法，所述胎鼠，其獲得的方法包括：(1)將孕鼠麻醉后取出串珠樣受孕子宮，放入含有500U-1000U青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS中浸泡；(2)將浸泡后的受孕子宮分離出連接胎鼠肚臍與胎盤的臍帶組織后，胎鼠放入含有500U-1000U高強(qiáng)度青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS的平皿中，洗滌后得到胎鼠。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種胎鼠肺來源內(nèi)皮祖細(xì)胞的提取分離培養(yǎng)方法通過以下實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)，包括以下步驟：

(1)將孕鼠麻醉后取出取出串珠樣受孕子宮，放入含有500U-1000U青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS中浸泡；

(2)將浸泡后的受孕子宮分離出連接胎鼠肚臍與胎盤的臍帶組織后，胎鼠放入含有各500U-1000U的青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷PBS的平皿中，洗滌；