[發(fā)明專利]一種胎鼠內(nèi)皮祖細胞的提取分離培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810147120.2
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108060116B
• 公開（公告）日: 2020-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 計曉娟;趙曉東;何燦粲;李亞男;朱旭;楊海燕;龔婷;李麗玲;曹麗娜
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 重慶樂泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50221
• 代理人: 劉佳

1.一種胎鼠肺來源內(nèi)皮祖細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）取胎鼠的肺臟，放入含有 500U-1000U青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷 PBS 中，并將肺組織破碎；

（2）用胰酶消化步驟（1）中的破碎組織；

（3）消化完后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)15-18小時；

（4）然后取出非貼壁的細胞，離心，取其沉淀；

（5）將步驟（4）的沉淀用含生長因子和FBS的血清的EBM-2培養(yǎng)基懸起，接種于孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（6）每2-4 天換一次液，當(dāng)原代細胞生長融合達 80-90% 時，用胰酶消化傳代培養(yǎng)，持續(xù)傳代直至細胞呈現(xiàn)均一形態(tài)即完成培養(yǎng)；

其中，所述胎鼠獲得包括：

（A）將孕鼠麻醉后取出串珠樣受孕子宮，放入含有 500U-1000U 青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷 PBS 中浸泡；

（B）將浸泡后的受孕子宮分離出連接胎鼠肚臍與胎盤的臍帶組織后，胎鼠放入含有500U-1000U 高強度青霉素和鏈霉素雙抗的預(yù)冷 PBS 的平皿中，洗滌后得到胎鼠。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（2）中所述洗滌，其洗滌次數(shù)為2次。

3.如權(quán)利要求1的方法，步驟（2）中所述的胰酶為0.25%胰酶，步驟（3）中DMEM培養(yǎng)基含10%FBS，培養(yǎng)時間為16小時。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（4）中所述離心為1000rpm，5min，步驟（5）中的EBM-2培養(yǎng)基含有2% FBS。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（5）的接種，細胞濃度為10⁶/ml，恒溫箱內(nèi)含有5%CO₂、溫度為37℃，步驟（6）中每3天換一次液，胰酶的濃度為0.25%。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（2）中所述胰酶消化是采用分步消化法，每步均置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育10min，直至組織完全消化。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（A）中所述浸泡，浸泡時間為3-5分鐘。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（A）中所述孕鼠為孕齡為15-19天的孕鼠。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，步驟（1）中所述破碎組織，破碎后的組織大小為 0.5-1.0mm³。