[發(fā)明專利]醇脫氫酶突變體及其在雙芳基手性醇合成中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810146472.6
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108359649A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 倪曄;周婕妤;許國超;王岳
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了醇脫氫酶突變體及其在雙芳基手性醇合成中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的醇脫氫酶突變體具有優(yōu)良的催化活性和立體選擇性，可高效催化制備一系列R?和S?構(gòu)型的手性雙芳基醇。將本發(fā)明的所述的醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶或甲酸脫氫酶進行偶聯(lián)，可用于多種抗組胺藥物手性雙芳基醇中間體的合成。與現(xiàn)有報道相比，本發(fā)明的醇脫氫酶不對稱催化還原制備雙芳基手性醇的方法具有操作簡便、底物濃度高、反應(yīng)完全、產(chǎn)品純度高的優(yōu)勢，具有很強的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醇脫氫酶突變體及其在雙芳基手性醇合成中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

手性雙芳基醇化合物是合成眾多藥物和精細化學(xué)品的關(guān)鍵手性中間體，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇(CPMA)是合成抗組胺藥物倍他司汀的關(guān)鍵手性中間體。以潛手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)為原料，通過化學(xué)法不對稱還原合成手性CPMA主要由以下五種技術(shù)實現(xiàn)：

1.在底物濃度為1.0mM條件下，以trans-RuCl₂[(R)-xylbinap][(R)-daipen]為催化劑，在壓力為40-60psi充氮氣條件下室溫反應(yīng)24h，還原獲得(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((S)-CPMA)，其ee值為60.6％，產(chǎn)率為98％。(C.Y.Chen,et al.,Org.Lett.,2003,5,5039-5042)。

2.以(S)-[Ru(BINAP)Cl₂]₂(NE₃)為催化劑，加壓，通氫氣，還原得到(S)-CPMA)，ee值為99％。(趙志全等,中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2006,37,726-727)。

3.以CPMK為原料，在底物濃度僅為0.2mM條件下以(S,S)-6-CHOONa為催化劑，在50℃條件下反應(yīng)24h，還原獲得的(R)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((R)-CPMA)，其ee值為40.8％，產(chǎn)率為90％。(B.G.Wang,Org.Lett.,2017,19,2094-2097)。

4.以CPMK為原料，采用三步反應(yīng)，1)先用三氟甲磺酸酐等進行保護，2)再用催化劑鈀配位體及Me-CBS等還原羰基到S構(gòu)型羥基，3)在三苯基磷鈀作用下脫保護，得到(S)-CPMA。(中國專利CN101848893A)。

5.以手性BINAL-H為手性還原劑，在底物濃度為400mM CMPK條件下定向合成單一構(gòu)型CPMA。進行乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶后，(R)-CPMA收率88.2％，純度96.2％，(S)-CPMA收率87.4％，純度95.7％。(中國專利CN103121966A)。

由此可見，上述反應(yīng)存在貴金屬配位體催化劑成本較高、底物濃度低、反應(yīng)需要高壓條件、操作步驟較多、物光學(xué)純度低的問題，不能滿足藥物對光學(xué)純度的要求，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

生物催化是指利用酶或者生物有機體(細胞、細胞器、組織等)作為催化劑進行化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程，作用條件溫和，在常溫、中性和水等環(huán)境中完成，對于手性活性藥物成分的合成具有獨特的優(yōu)點。符合“可持續(xù)發(fā)展”、“綠色化學(xué)”、“環(huán)境友好制造”等工業(yè)發(fā)展的目標。與化學(xué)合成方法相比，使用醇脫氫酶將潛手性酮中的羰基進行不對稱還原的反應(yīng)具有立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，具有重要的經(jīng)濟、社會價值和生態(tài)意義。生物不對稱還原法主要可通過以下四種技術(shù)實現(xiàn)：

1.2007年，Truppo等篩選了一系列商品化酮還原酶KRED后，發(fā)現(xiàn)雖然有一些酮還原酶對雙芳基底物有還原能力，但立體選擇性一般，且底物譜較窄，底物中的取代基團對立體選擇性的影響較大。僅KRED124可以不對稱還原CPMK生成(R)-CPMA，ee值為94％，轉(zhuǎn)化率98％，且需要外加葡萄糖脫氫酶提供輔酶循環(huán)。(M.D.Truppo,Org.Lett.,2007,9,335-338)。