[發明專利]醇脫氫酶突變體及其在雙芳基手性醇合成中的應用

在審

• 申請號: 201810146472.6
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108359649A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 倪曄;周婕妤;許國超;王岳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種醇脫氫酶的突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示醇脫氫酶的一個或多個氨基酸位點進行突變。

2.根據權利要求1所述突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列為SEQ IDNo.2醇脫氫酶的第136位谷氨酰胺、第161位苯丙氨酸、第196位絲氨酸、第214位谷氨酸、第215位蘇氨酸、第237位絲氨酸中的一個或多個位點僅突變。

3.根據權利要求1或2所述突變體，其特征在于，所述突變體位以下M1～M7：

M1是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為甘氨酸；

M2是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為纈氨酸；

M3是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為甘氨酸，同時第237位絲氨酸替換為半胱氨酸；

M4是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為甘氨酸，同時第237位絲氨酸替換為半胱氨酸，第136位谷氨酰胺替換為天冬酰胺；

M5是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為甘氨酸，同時第237位絲氨酸替換為半胱氨酸，第136位谷氨酰胺替換為天冬酰胺，第196位絲氨酸替換為甘氨酸；

M6是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為甘氨酸，同時第237位絲氨酸替換為半胱氨酸，第136位谷氨酰胺替換為天冬酰胺，第196位絲氨酸替換為甘氨酸，第161位苯丙氨酸替換為纈氨酸；

M7是將氨基酸序列如SEQ ID No.2所示醇脫氫酶的第214位谷氨酸替換為纈氨酸，同時第215位蘇氨酸替換為絲氨酸。

4.編碼權利要求1-3任一所述突變體的核苷酸序列。

5.表達權利要求1-3任一所述突變體的重組菌。

6.構建權利要求5所述重組菌的方法，其特征在于，具體步驟如下：將編碼所述突變體的核苷酸序列克隆到重組載體中，將所得重組載體轉化到宿主中，得到重組轉化體，通過培養所得重組表達轉化體，即可分離純化獲得所述突變體。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述重組菌的宿主為大腸桿菌(Escherichiacoli)，所述質粒為pET28a(+)。

8.根據權利要求6或7所述方法，其特征在于，重組菌的宿主為E.coli BL21(DE3)。

9.應用權利要求5所述重組菌生產醇脫氫酶突變體的方法，其特征在于，所述方法為：將重組菌接種至含有40-60μg/mL硫酸卡那霉素的LB培養基中，30～40℃，100～200rpm搖床培養，培養液的吸光度OD₆₀₀達到0.5～1.0時，加入0.05～1.0mM的異丙基-β-D-六代呋喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導，誘導溫度為16～30℃，誘導5～10h即可獲得高效表達重組醇脫氫酶的突變體。

10.一種應用醇脫氫酶生產手性CPMA的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：構建反應體系，CPMK濃度為10-500mM，權利要求1-3任一所述脫氫酶突變體用量為1-10kU/L，NADP⁺用量為0.1～1.0mM，加入輔酶循環系統，輔酶循環系統中含有葡萄糖脫氫酶GDH和D-葡萄糖，其中葡萄糖脫氫酶GDH用量為1～10kU/L，D-葡萄糖用量為20～1000mM，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.1-0.2M；在30～35℃，pH 6～8的條件下反應1～24h，不對稱還原反應結束后，可按照有機溶劑萃取方法從反應液中提取手性CPMA；所述輔酶循環系統還可以是亞磷酸鹽/亞磷酸鹽脫氫酶(FTDH)、甲酸/甲酸脫氫酶(FDH)、乳酸/乳酸脫氫酶(LDH)或甘油/甘油脫氫酶。