[發(fā)明專利]一種利用小分子化合物誘導人多能干細胞分化為肝細胞的方法

有效

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• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108486037B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張琪;杜聰;奉源;許燕;邱東波
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學附屬第三醫(yī)院(中山大學肝臟病醫(yī)院)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

本發(fā)明公開了一種誘導人多能干細胞分化為肝細胞的方法。本方法步驟為：誘導人多能干細胞分化為限定性內(nèi)胚層細胞；誘導限定性內(nèi)胚層細胞分化為肝祖細胞；誘導肝祖細胞分化成熟為肝細胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，誘導分化過程全部采用小分子化合物和成分明確的培養(yǎng)基及添加劑，避免使用細胞因子和成分不明確的培養(yǎng)基，體系穩(wěn)定、可重復性好；小分子化合物比細胞因子的成本低，與傳統(tǒng)的細胞因子方法比較，可以降低2/3的成本，所以整個誘導分化過程更加低廉，有利于將來進一步的擴大分化應(yīng)用；誘導分化過程耗時13天，是目前國內(nèi)外報道的誘導分化方案中耗時最短的全小分子誘導分化方案；使用DMSO濃度低，對于細胞的毒性小。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細胞生物學及再生醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用小分子化合物誘導人多能干細胞(包括人iPS細胞和人胚胎干細胞)分化為肝細胞的方法。

背景技術(shù)

對于各種終末期肝病，肝移植是迄今為止最有效的治療手段。但供肝嚴重短缺成為限制其發(fā)展的全球性難題。因此，尋找合適的替代療法迫在眉睫。肝細胞移植從某種程度上可以緩解這一難題，但同樣存在肝細胞資源缺乏并且體外擴增困難等問題。近年來，隨著干細胞和再生醫(yī)學研究如火如荼地開展起來，一系列進展為人類攻克肝臟疾病的治療難題帶來了新希望。人多潛能干細胞作為一類具有自我更新和多向分化特性的細胞，可以源源不竭地在體外被誘導分化為成熟的具有功能的肝細胞，動物實驗初步驗證的誘導分化的肝細胞是安全有效的。另外這些誘導分化的肝細胞還可以被用來進行藥物篩選、生物人工肝治療和構(gòu)建肝臟疾病模型。

但是目前常用的誘導分化方案包括細胞因子誘導分化(通過在不同的分化培養(yǎng)基中加入細胞因子，包括Wnt3a，ActivinA，F(xiàn)GF，BMP4，HGF，OSM等)、利用慢/腺病毒技術(shù)將肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子導入多能干細胞中誘導其分化，另外還有細胞共培養(yǎng)的方法等，以上誘導分化方法都存在諸多不足和問題，比如誘導分化效率受限、時間長、成本高、可控性和穩(wěn)定性差等。而近年來小分子化合物在干細胞研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，小分子化合物自身眾多優(yōu)勢是細胞因子等誘導分化方法所無可比擬的，有望在誘導肝分化領(lǐng)域大展用武之地。

與傳統(tǒng)的細胞因子相比，小分子化合物有如下優(yōu)勢：①小分子化合物可直接穿過細胞膜作用于相應(yīng)的靶點上，因此起效較快；②小分子化合物的靶點不僅限于信號通路，還可以直接影響表觀遺傳學狀態(tài)；③小分子化合物具有相對特異的靶點，利于深入研究其機制；④小分子化合物不僅起效迅速，而且其效應(yīng)是可逆的，便于操控，可實現(xiàn)對基因表達和蛋白質(zhì)功能進行精準調(diào)控；⑤小分子化合物的獲取方便，而且比較穩(wěn)定，便于將來標準化和規(guī)模化地應(yīng)用。

目前，盡管小分子化合物在干細胞研究領(lǐng)域應(yīng)用較多，但是可用于誘導人多潛能干細胞分化為肝細胞的小分子化合物方案寥寥無幾。

現(xiàn)有利用小分子化合物誘導人多能干細胞分化為肝細胞的方法為Small-Molecule-Driven Hepatocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells(Stem Cell Reports(2015)，Richard Siller,Sebastian Greenhough,Elena Naumovska,1and Gareth J.Sullivan.)，該方法分為四個主要階段：中內(nèi)胚層分化、限定性內(nèi)胚層誘導形成、肝譜系特化和肝細胞分化成熟。但是該方法存在以下缺陷：誘導時間較長(17天)；實驗體系不穩(wěn)定，細胞損傷較重(1％DMSO有較重的細胞毒性)；實驗可重復性差(第一階段僅僅通過調(diào)控Wnt信號通路難以高效率地誘導限定性內(nèi)胚層分化；第二階段僅僅通過DMSO難以定向地誘導限定性內(nèi)胚層細胞分化為肝系細胞)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種利用小分子化合物誘導人多能干細胞分化為肝細胞的方法。

本發(fā)明的第二個目的是所述方法在定向誘導人多能干細胞分化為肝細胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述方法在制備定向誘導人多能干細胞分化為肝細胞的試劑盒中的應(yīng)用。