[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810145987.4
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108384741B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳敬;宿玲恰;李云菲
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建pHYα/βCGTd4、pHYα/βCGTd4?sp1和pHYα/βCGTd4?sp1?βN三種Bacillus stearothermophilus來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化表達宿主枯草芽孢桿菌WSH13，得到三種表達環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組工程菌B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4?sp1)、B.subtilis WSH13(pHYα/βCGTd4?sp1?βN)，搖瓶酶活分別為7.99U/mL、11.99U/mL和12.65U/mL，3L罐酶活分別為110.4U/mL、150.3U/mL和225.9U/mL。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因工程菌，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

維生素C是一種水溶性維生素，參與人體多項生理活動，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。然而，由于自身不穩(wěn)定，易被氧化降解的性質(zhì)，嚴重影響應(yīng)用。因此VC衍生物成為研究熱點，其中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗壞血酸(AA-2G)，具有Vc正常生理功能、安全性高，并且在胞外穩(wěn)定存在，成為很好的VC替代品。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase，簡稱CGTase，EC 2.4.1.19)具有環(huán)化、歧化和耦合三種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)和水解反應(yīng)。CGTase利用偶聯(lián)和歧化兩種特異轉(zhuǎn)糖基作用將淀粉、環(huán)糊精等葡萄糖基供體上的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到Vc的C-2位上，得到產(chǎn)物AA-2G_n(n＝1，2，3，4，5，6，7)，再利用葡糖淀粉酶(glucoamylase)將AA-2G_n較長的糖鏈降解為成只連接一個葡萄糖基團的AA-2G。影響AA-2G轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇，目前為止，有報道的用于AA-2G合成的糖基轉(zhuǎn)移酶共有5種，分別為α-淀粉酶(α-amylase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphatase)、α-異麥芽糖基葡糖基糖合成酶(α-isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)和環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransferase)。其中尤以環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)的強產(chǎn)物特異性而使其成為目前AA-2G生物合成中使用最廣泛的酶種。B.Stearothermophilis來源的α/β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α/β-CGTase)具有合成AA-2G的優(yōu)良性能。本實驗室已成功將α/β-CGTase在E.coli異源表達，但AA-2G作為食品、醫(yī)藥添加劑，需要以食品安全菌株作為宿主生產(chǎn)CGTase。

枯草芽孢桿菌B.subtilis是一類廣泛分布革蘭氏陽性桿狀好養(yǎng)型細菌，具備無致病性，環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，而且還具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，其培養(yǎng)簡單快速，具有較強的分泌蛋白質(zhì)的能力，目前廣泛用于生產(chǎn)各種工業(yè)用酶?？莶菅挎邨U菌遺傳背景清晰，實驗?zāi)Ｊ骄闎.subtilis 168已完成全基因組測序，并根據(jù)發(fā)酵工藝需求改造成多種突變體，例如工業(yè)上使用的菌株B.subtilis WB600和B.subtilis WB800。B.subtilisWSH13是本實驗室以B.subtilisATCC 6051a為出發(fā)菌株經(jīng)過定向基因組改造，實現(xiàn)高密度發(fā)酵的菌株，減少了發(fā)酵過程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的產(chǎn)生。

為了提高CGTase在枯草枯草芽孢桿菌的異源表達，處理選擇合適的表達載體和啟動子外，篩選出匹配度高的信號肽也是提高表達量的有效手段。不同的信號肽對不同的異源蛋白表達量的影響不盡相同，毛婷等在枯草芽孢桿菌WB600表達系統(tǒng)篩選不同信號肽(est A、bpr、vpr、ync M、yvg O和ywb N)對CGTase表達量的影響，在相同的發(fā)酵條件下，estA信號肽介導(dǎo)的分泌效果最好。前人篩選信號肽所用的樣本量較小，通過高通量平臺從大樣本中篩選出一個適合α/β-CGTase的信號肽就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容