[發明專利]一種高產環糊精葡萄糖基轉移酶的基因工程菌

有效

• 申請號: 201810145987.4
• 申請日: 2018-02-12
• 公開（公告）號: CN108384741B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;李云菲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一株枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表達了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的環糊精葡萄糖基轉移酶α/β-CGTase；所述基因工程菌的宿主菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WSH13，所述枯草芽孢桿菌WSH13是以B.subtilis ATCC6051a為出發菌株，通過敲除核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的側柏素合成酶ppsE基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶sfp基因得到；用于分泌表達所述環糊精葡萄糖基轉移酶α/β-CGTase的信號肽sp1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述環糊精葡萄糖基轉移酶α/β-CGTase的N前端12個氨基酸替換為氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的15個氨基酸。

2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以pHYd4為載體構建得到。

3.權利要求1或2所述基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法具體是：

(1)以B.circulans環糊精葡萄糖基轉移酶基因為模板擴增得N端前15個氨基酸的核苷酸序列，以B.stearothermophilus環糊精葡萄糖基轉移酶為模板擴增除N端前12個氨基酸的核苷酸序列，利用重疊PCR的方法，將兩端序列連接，得到重組環糊精葡萄糖基轉移酶基因βN-α/βcgt；

(2)以pHYd4為模板擴增載體片段，利用重疊PCR連接sp1與載體片段，得環糊精葡萄糖基轉移酶表達載體pHYd4-sp1；

(3)以pHYd4-sp1為模板擴增載體片段，連接載體pHYd4-sp1與重組環糊精葡萄糖基轉移酶基因βN-α/βcgt，構成表達質粒pHYα/βCGTd4-sp1-βN；

(4)然后轉化B.subtilis WSH13，得到基因工程菌。

4.權利要求1或2所述基因工程菌高密度發酵的方法，其特征在于，所述方法是將所述枯草芽孢桿菌基因工程菌接種至發酵培養基中，控制pH6.5～7.5，培養溫度32～35℃，先溶氧維持在25～35％，至溶氧迅速上升，開始流加補料液培養基，當環糊精葡萄糖基轉移酶酶活下降時，結束培養。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基為：酵母粉10～20g/L，玉米漿20～30g/L，葡萄糖10～15g/L，(NH₄)₂-H-citrate 0.5～1.5g/L，Na₂SO₃ 1.5～2.5g/L，(NH₄)₂SO₄2～3g/L，K₂HPO₄·3H₂O 18～20g/L，NaH₂PO₄·H₂O 3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g/L，金屬離子PTM溶液2～4ml/L；所述金屬離子PTM溶液的組成為：CuSO₄·5H₂O 5～7g/L，KI 0.05～0.1g/L，MnSO₄·H₂O 0.4～0.6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.3g/L，H₃BO₃ 0.01～0.03g/L，CoCl₂ 0.4～0.6g/L，ZnCl₂ 15～25g/L，FeSO₄·7H₂O 60～70g/L，生物素0.1～0.3g/L，H₂SO₄ 4～6g/L。